研究背景及目的:前列腺癌(Prostate cancer,PCa)是仅次于肺癌的第二常见恶性肿瘤,也是全世界男性肿瘤相关死亡的第五大原因。前列腺特异性抗原(Prostate specific antigen,PSA)已成为最广泛使用的诊断前列腺癌的生物标志物。然而,PSA并非肿瘤特异性,PSA水平与PCa进展的相关性欠佳,这限制了PSA在PCa分期及预后中的应用。前列腺穿刺活检是一种在临床实践中能够明确诊断PCa的检查方法,但是因其有创性,部分患者难以接受。因此,迫切需要特异性较强的生物标志物用于检测、诊断PCa和判断PCa的预后。目前,局限性前列腺癌患者通常采用手术治疗或放射治疗。然而,20%-40%的接受根治性前列腺癌切除术的患者和30-50%的接受放疗的患者将会出现复发并发展为转移性疾病。转移性去势抵抗型前列腺癌目前没有最为理想的治疗方法,患者大都预后不良,因此需要开发更为有效的治疗方法。近年来,生物免疫治疗已成为备受关注的疗法。研究表明,部分肿瘤细胞通过激活负向刺激信号,调控抑制性免疫应答反应,来逃避免疫系统的识别和杀伤。此外,肿瘤细胞也可以招募某些免疫抑制细胞,直接或间接的介导免疫抑制因子的释放,共同促进免疫抑制肿瘤微环境的发生、发展,从而明显促进肿瘤进展。因此,一些具有免疫抑制功能的细胞因子受到了极大的关注,如转化生长因子(TGF)-β、白介素(IL)-6和IL-35等。IL-35是最新发现的免疫抑制性细胞因子,目前已成为肿瘤生物免疫相关领域研究的热点。研究结果表明,IL-35在多种肿瘤组织中都有高表达,具有促进肿瘤血管生成和抑制抗肿瘤细胞毒性淋巴细胞反应的作用;在多种不同类型恶性肿瘤中,血浆IL-35水平与肿瘤分期、肿瘤大小和癌旁淋巴结转移密切相关;IL-35在肿瘤组织中的高表达及其在血浆中的升高提示肿瘤预后不良。目前关于PCa的临床研究结果表明,PCa患者血清IL-35的平均浓度明显高于健康对照组,说明IL-35可能参与肿瘤的发生。关于IL-35在PCa肿瘤组织中的表达情况以及IL-35对于PCa进展及转移的影响及作用机制的研究尚无有关报道。因此,本研究旨在检测免疫抑制细胞因子IL-35在PCa患者血浆和肿瘤组织中的表达水平;检测IL-35在不同前列腺癌细胞系的表达情况,并探索IL-35对前列腺癌细胞的侵袭、迁移和增殖的影响;分析IL-35对皮下PCa荷瘤小鼠的肿瘤增殖、血管生成、转移及免疫微环境的影响。从临床、体外细胞及动物体内实验三个水平探索IL-35对前列腺癌发生和发展中的作用,并探讨相关的调控机制。方法:1.采用ELISA检测PCa患者血浆中IL-35的水平,分析患者血浆IL-35水平与各项临床指标和病理特征的相关性。并建立受试者操作特征曲线(ROC),分析IL-35在PCa诊断中的临床应用价值。采用生存曲线比较不同IL-35水平的PCa患者总生存率的差异。使用人PCa组织芯片进行免疫组化染色,检测人PCa组织中IL-35的表达,并分析IL-35两个亚基的表达与临床病理指标之间的关系。2.采用Western blot和RT-PCR的方法检测IL-35的两个亚基在三种人PCa细胞系(LNCaP、DU145、PC-3)和小鼠PCa细胞系RM-1中的蛋白和mRNA的表达。对体外培养的PCa细胞分组进行不同处理,使用Transwell小室、划痕实验CCK-8试验检测各组细胞的侵袭、迁移和增殖能力。3.构建RM-1荷瘤小鼠PCa模型,分为四组进行不同处理:Control、IL-35组、Scramble组和IL-35中和抗体组。每组分别绘制肿瘤生长曲线、小鼠生存曲线。ELISA检测各组小鼠血浆IL-35水平;肿瘤组织分别进行免疫组化及Western blot,检测各组IL-35的两个亚基EBI3和p35、血管生成指标CD31和细胞增殖指标Ki67的蛋白表达;肺组织进行HE染色,计算各组小鼠肺转移率;流式细胞计数检测各组小鼠脾脏及血液中的MDSCs、Treg、CD4~+T、CD8~+T细胞的比例差异。结果:1.PCa患者血浆IL-35浓度明显高于前列腺增生组和健康对照组。PCa患者血浆IL-35浓度随肿瘤分期的进展而升高,并与Gleason评分呈正相关。有局域淋巴结转移及远处转移的患者血浆IL-35浓度分别高于无局域淋巴结转移和无远处转移者。血浆IL-35浓度高者总生存率明显低于低浓度者。IL-35对PCa患者有无淋巴结转移和有无远处转移的ROC曲线下面积高于PSA。2.IL-35的两个亚基EBI3和p35在PCa组织中的表达均明显高于癌旁组织。随着Gleason评分的增加,EBI3和p35的表达也明显增加。3.EBI3和p35蛋白在人高转移PCa细胞系PC-3和小鼠RM-1细胞系中均高表达,而中度转移潜能的DU145细胞系和激素敏感性细胞LNCap细胞系中主要表现为EBI3水平表达较高,而p35相对较低。与此对应,EBI3和p35的mRNA在PC-3和小鼠RM-1细胞系中均高表达,而DU145和LNCap细胞系中主要表现为EBI3水平表达较高,而p35相对较低。4.与对照组比较,加入IL-35可明显增加transwell下室细胞的数量PCa细胞的覆盖面积以及CCK-8实验中的光密度值;而IL-35中和抗体组transwell下室细胞的数量、PCa细胞愈合比例和OD值则较Scramble组明显减少。5.IL-35促进小鼠PCa肿瘤体积的增长,增加了肺转移的比例,降低了小鼠的整体生存率。小鼠PCa组织中,IL-35组CD31和Ki67表达升高,IL-35中和抗体组CD31和Ki67表达下降。6.IL-35增加肿瘤微环境中调节性T细胞(Treg)和骨髓源性抑制性细胞(MDSCs)的比例,降低CD4~+和CD8~+T细胞的比例。IL-35中和抗体组Treg、MDSCs的比例下降,CD4~+和CD8~+T细胞的比例升高。结论:1.IL-35在PCa患者的血浆和组织中高表达,其与PCa的发生、进展、转移和不良预后呈正相关,可能成为PCa进展过程中重要的生物标志物。2.IL-35对于PCa细胞的侵袭能力、迁移能力和细胞增殖能力有促进作用;中和IL-35后可明显抑制PCa细胞侵袭能力、迁移能力和细胞增殖能力。3.IL-35与小鼠PCa的进展、转移和不良预后相关,IL-35可作为治疗PCa的新靶点。4.IL-35通过上调CD31和Ki67促进小鼠PCa的血管生成和细胞增殖,从而促进肿瘤生长;中和IL-35治疗可以抑制小鼠PCa的血管生成和细胞增殖,从而抑制PCa进展。5.IL-35通过上调Treg细胞和MDSCs,抑制CD4~+、CD8~+T细胞,从而促进免疫抑制,促进PCa的恶性进展;中和IL-35治疗可能抑制PCa进展。