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磷霉素[(-)-(1R,2S)-1,2-epoxypropylphosphonic acid,fosfomycin]是迄今为止发现的结构最简单的抗生素。它的结构独特,有一个环氧键和一个自然界中不常见的P-C键。它对革兰氏阳性细菌和阴性细菌均具有杀灭作用。目前工业上以化学全合成法生产磷霉素,在化学合成中磷霉素的直接前体物质是顺丙烯磷酸。
筛选到一株能不对称地将顺丙烯磷酸转化成磷霉素的细菌菌株S101,经过形态观察,生理生化实验和16S rDNA鉴定,确定该菌株为Bacillus simplex。
建立了用气相色谱(GC)检测磷霉素的方法。这种方法不仅能精确地检测磷霉素的含量,也能监测底物顺丙烯磷酸的减少量。
确定了Bacillus simplex strain S101菌株将顺丙烯磷酸转化成磷霉素的最佳条件。在转化培养基中,顺丙烯磷酸的最佳浓度为2000μg/ml;甘油是转化培养基的最好碳源;培养基的最适起始pH为9.0;氧气分子是S101菌株生长所必需的,而转化过程不需要氧气分子的存在;钒酸根离子是转化所必需的。
当底物顺丙烯磷酸的浓度为2000μg/ml,发酵6天后,产生的磷霉素的浓度为1838.2μg/ml,转化率为81.3%。这是已经报道的在高浓度底物(>1000μg/ml)下最高的转化率。
用蛋白质组学方法研究了Bacillus simplex strain S101菌株在顺丙烯磷酸的诱导下的蛋白表达的变化情况。当Bacillus simplex strain S101菌株在没有底物时,在pH4-7的范围内检测到422个蛋白点;在有底物时,检测到415个蛋白点。有11个差异表达的蛋白点,其中有4个蛋白点的表达量下调,7个蛋白点上调,没有非常明显的底物诱导表达蛋白点。对差异表达的蛋白点进行质谱分析,没有鉴别出相应蛋白。这是由于缺乏Bacillus simplex菌种的基因组数据。
发现Bacillus属的另一株菌,Bacillus subtilis strain168也能将顺丙烯磷酸转化成磷霉素。在同样的转化培养基中发酵6天后,磷霉素的产量可达816.6μg/ml。
由于已经得到了Bacillus subtilis strain168菌株的基因组数据,因此试图用蛋白质组学方法揭示微生物将顺丙烯磷酸转化成磷霉素的机理。在有底物顺丙烯磷酸的培养基中生长时,细胞蛋白质的2-D图谱与没有底物时的2-D图谱相比,差异比较大。在没有底物时,在pH4-7的范围内检测到527个蛋白点;而在有底物时,检测到562个蛋白点。二者进行比较,结果发现有98个差异表达蛋白。其中在有底物存在时,表达量下调的的点有20个,表达量上调的点52个,底物特异性表达的点有26个。经质谱鉴定,共鉴定到80个差异表达蛋白点,其中鉴定出上调的点45个,下调的点17个,按照蛋白功能进行分类,这些蛋白分别参与胞内的不同代谢过程。其中10个参与胁迫反应,11个蛋白参与合成胞内酶促反应的辅助因子,3个蛋白点与氧化还原反应有关,5个蛋白与物质转运有关,5个点与核苷酸代谢有关,20个点参与糖代谢,16个点参与氨基酸和蛋白质的代谢,10个点参与其他的代谢途径,顺丙烯磷酸诱导表达的特异性蛋白点18个,没有鉴定出来的蛋白点有48个。
根据对Bacillus subtilis strain168菌株蛋白质组学分析,推测菌株是通过两步将顺丙烯磷酸转化成磷霉素的。第一步是水化反应,第二步是脱氢反应。
角蛋白(Keratin)是一种广泛存在于自然界中的硬性蛋白,主要存在于各种动物的皮肤的角质层、毛发、鳞片、羽毛、蹄、角等结构中。角蛋白化学结构稳定,不溶于水,也不能被一般的蛋白酶所降解。微生物来源的角蛋白酶(keratinase)可以有效地降解角蛋白,因此,该酶在工业上具有广泛的应用前景。
本研究利用人的脚皮(NHFS)作为角蛋白酶的诱导物,发现Streptomyces sp.strain16菌株在发酵的过程中能将NHFS完全降解,显示该菌株能分泌很高活性的角蛋白酶。
从Streptomyces sp.strain16菌株的发酵液中纯化出了4种角蛋白酶,根据从Sephacryl S-200凝胶柱上洗脱下来的顺序,分别命名为KI、KII、KIII和KIV。
4种角蛋白酶的SDS-PAGE表现的分子量分别为25 KDa,、50 KDa、34 kDa和19 kDa,Superose1210/300 GL凝胶柱层析分析4种角蛋白酶天然状态下的分子量分别为203.2 kDa、100.8 kDa、31.8 kDa和19.2 kDa。推导它们分别为同源八聚体、同源二聚体、单聚体和单聚体。其中,天然状态下的Ⅺ是由8个分子量为25 kDa的相同单体组成的同源八聚体,它的分子量达到了203.2 kDa,这在微生物角蛋白酶中是非常少见的。
研究了4种角蛋白酶的酶学性质。4种角蛋白酶的最适pH都为9.0。KI、KII和KIII的最适反应温度为50℃,KIV为60℃。4种角蛋白酶的活性都被PMSF强烈抑制,说明它们都属于丝氨酸蛋白酶;EDTA抑制KI、KII和KIII的活性,对KIV没有作用。还原剂对4种角蛋白酶的活性有促进作用。4种角蛋白酶对酪蛋白和NHFS都有很强的降解活性。
对4种角蛋白酶的N端进行了分析,结果表明,KI、KII和KIII为在结构上不同于其他的新的角蛋白酶,KIV和来源于S.fradiae的SFase-2是相同的酶。