蛋白质或者多肽在某些条件下可产生淀粉样变性形成纤维,沉积于细胞膜,造成细胞损害,最终导致细胞凋亡。大量的研究证实,一些天然多酚类物质可以抑制蛋白质的纤维化,并能够破坏成熟的纤维结构,将其转变为无定形聚集体。表没食子儿茶素-3-没食子酸(EGCG)是绿茶的主要生物活性成分,具有多方面的药理作用,包括抑制多肽纤维化及降低纤维细胞毒性,目前已被用于神经退行性疾病的临床治疗。本研究采用溶菌酶和牛胰岛素作为实验模型,探索EGCG在中性和弱碱性条件下的稳定性,并比较其氧化产物对蛋白质纤维化的抑制作用。结果发现,EGCG在中性和弱碱性条件下,很快转化成为较为稳定的氧化产物,其氧化产物具有比EGCG更强的抗蛋白质纤维化作用。此外,运用质谱对EGCG氧化产物的化学结构进行了鉴定。目前普遍认为,EGCG的抗蛋白质淀粉样纤维化的作用主要源于其完整分子与多肽链间的非共价作用,忽略了 EGCG的不稳定性和氧化产物的作用。本研究的重要性在于,首次揭示了 EGCG氧化产物才是其抗蛋白质纤维化作用的主要成分,为淀粉样纤维化疾病的治疗提供了新的先导药物结构。主要的实验方法和实验结果:1、溶菌酶和牛胰岛素的纤维生长动力学采用ThT(硫磺素T,ThioflavineT)荧光标记技术和ANS(8-苯胺基-1-萘磺酸,8-Anilino-1-naphthalenesulfonicacid)荧光标记法检测蛋白质的纤维化过程。ThT用于检测蛋白质纤维化过程中β-折叠含量的变化,ANS荧光探针检测纤维化过程中蛋白质疏水区域的暴露情况,圆二色谱(CD)和透射电子显微镜(TEM)对纤维生长过程中二级结构和形貌的变化进行表征。实验结果表明,溶菌酶和牛胰岛素在纤维化过程中β-折叠结构增加,α-螺旋结构减少,蛋白质内部的疏水性区域逐渐暴露。通过TEM观察发现溶菌酶和牛胰岛素的成熟纤维具有典型纤维形态。此外,实验结果表明震荡和加盐会加快纤维生长的速率,缩短纤维生长的周期。2、EGCG的化学稳定性采用HPLC、UV、LC-MS、MS以及MS/MS等技术检测EGCG氧化动力学过程,实验结果表明,在中碱性条件下,EGCG易于发生氧化且有其对应氧化产物的生成。UV检测发现EGCG氧化产物与EGCG具有相似的共轭结构。HPLC-MS结果表明EGCG氧化12 h后形成了两种较为稳定的氧化产物,对应的分子离子峰为169和225。其中169对应为去质子化的没食子酸,而质荷比为225离子的结构目前尚不清楚。通过MS/MS进一步分析并推断了 EGCG可能的降解途径。3、EGCG和EGCG氧化产物对蛋白质纤维化过程的影响采用溶菌酶和牛胰岛素为模型蛋白,对比EGCG和EGCG氧化产物对纤维生长过程的影响。实验结果表明:EGCG氧化产物对蛋白质纤维化的抑制作用强于EGCG完整分子,且EGCG氧化程度越高对纤维化的抑制作用越强。另外,随着纤维生长速度的加快,EGCG完整分子抑制纤维生长的能力越低,而EGCG氧化产物抑制纤维的生长不受纤维生长速度的影响。通过NBT染色得出,EGCG氧化产物与蛋白作用后形成醌式结构的含量多于EGCG完整分子,推测醌式结构的形成对抑制蛋白淀粉样纤维化具有重要的作用。4、EGCG和EGCG氧化产物对成熟溶菌酶纤维的解聚作用在成熟的溶菌酶纤维中分别加入EGCG和EGCG氧化产物,孵育后离心处理。实验结果表明EGCG氧化产物对成熟纤维有更强的解聚能力。而加入抗坏血酸后,EGCG对成熟纤维的聚沉作用消失,由此表明EGCG的氧化是成熟纤维聚沉的必要条件。为了进一步探究纤维聚沉的原因,Zeta电位仪和ANS荧光探针的实验结果表明,EGCG氧化产物降低了纤维表面的电荷量,导致纤维聚沉析出形成白色的絮状沉淀。在聚沉过程中,纤维原有的疏水性区域不断减少,推测原因是纤维原有的疏水性区域包裹在沉淀的内部。5、EGCG氧化产物诱导溶菌酶形成低聚物的细胞毒性红细胞溶血实验结果表明,在纤维生长过程中形成的寡聚体或原纤维的细胞毒性远大于成熟纤维。与EGCG完整分子相比较,其氧化产物与溶菌酶单体结合后形成低聚物的细胞毒性低于EGCG完整分子。结合ANS疏水性检测的结果对这一现象进行分析,EGCG氧化产物能够降低纤维原有的疏水性表面,这可直接导致与细胞作用时,所形成的聚集体不能进入细胞膜的疏水层,从而使纤维的细胞毒性降低。6、黄烷醇类多酚对蛋白质纤维化过程的影响选取与EGCG结构相似的黄烷醇类多酚EGC、ECG和C作为研究对象,对比四种化合物的氧化行为和抗纤维化活性,并比较分析其构效关系。采用HPLC和UV检测四种黄烷醇类多酚的氧化过程。结果表明,B环和D环上羟基的数量和位置对黄烷醇类多酚的氧化和抑制蛋白纤维化过程具有重要的作用。此外,没食子酰基部分对形成更强抗纤维化的氧化产物具有不可替代性。结论:EGCG在中碱性环境下易被氧化,在pH=8.0的碱性条件下EGCG半衰期小于2 h。通过不同的检测方法表明EGCG氧化产物的抗纤维化能力强于EGCG完整分子,EGCG氧化产物转变为醌式化合物与多肽结合形成醌式蛋白,诱导溶菌酶单体形成更低细胞毒性的低聚物。同时,EGCG氧化产物对成熟纤维有更强的解聚能力,EGCG的氧化是对成熟纤维解聚的必要条件。对比四种黄烷醇类多酚的构效关系,在抗纤维化或形成具有更好抗纤维化的氧化产物过程中,B环和D环起着非常重要的作用。