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水稻白叶枯病是由Xanthomonas oryzae pv.oryzae(Xoo)引起的一种毁灭性病害,可造成水稻大量减产。抗病品种的利用是一种经济且对环境友好的防治手段,但是其前提是需要不断挖掘新的抗白叶枯病基因资源并明确抗病基因功能。本研究利用前期诱变获得的广谱高抗白叶枯病的水稻类病变突变体hpil3开展了抗病目标基因定位、克隆,蛋白组学,目标基因的互作基因筛选等相关研究,同时对疣粒野生稻中RCA在抗白叶枯病中的作用机理进行了研究。主要研究成果如下:利用hpil3和其野生型大粒香水稻通过基于重测序的图位克隆策略成功定位并克隆了该突变体的目标基因。该基因定位在4号染色体的20-22Mb区域内,进一步筛选得到7个候选的基因。通过对突变位点的验证和生物信息学分析最终确定了一个可能性较大的候选基因。转基因功能互补验证结果表明,该野生型基因成功使hpil3的表型恢复为野生型并丧失了对白叶枯病的抗性,从而确证了该候选基因就是hpil3的目标基因。通过实时荧光定量PCR发现hpil3中病程相关基因PR1a、PR1b、PR5、PR10表达量显著高于其野生型大粒香(DLX),而PR9略高于DLX;未接病菌的hpil3体内的HPIL3表达量显著高于野生型,这可能是由于基因突变导致的功能丧失从而使植株提高了该基因的表达量;突变体中HPIL3的表达量受白叶枯病菌诱导表达,且接菌后该基因表达量迅速升高,分析认为该基因与水稻抗白叶枯病具有相关性。对hpil3和DLX不同叶位进行荧光差异双向凝胶电泳结合质谱分析鉴定了291个差异表达倍数≥1.5倍且t-test≤0.05的蛋白,其中74个蛋白上调,217个蛋白下调。这些蛋白功能涉及氨基酸/蛋白代谢和修饰、光合作用、核苷酸代谢、防御相关、能量代谢、糖代谢、氧化还原等。进一步的数据分析显示hpil3多种主要的代谢途径如光合作用、糖酵解/糖异生、磷酸戊糖途径、卡尔文循环相关酶的表达量大多跟hpil3类病变表型发生程度呈负相关。一些抗病相关蛋白如PR10、14-3-3蛋白上调,而负调控细胞凋亡的AAA-type ATP酶下调,同时抗氧化的酶包括超氧化物歧化酶(SOD)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)和过氧化物酶(POD)上调,这些结果表明hpil3植株体内产生了抗性反应,与此同时各种相关代谢途径也受到影响,为了保持细胞稳态,ROS清除系统也在发挥积极的作用。采用酵母双杂交筛选到四个hpil3目标基因的互作基因。这些互作基因经过了基因全长的酵母双杂验证。其中质体蓝素和光系统Ⅱ的23kDa多肽是叶绿体蛋白。另外两个蛋白其中一个是包含C末端结构域的YL1核蛋白和一个胁迫应答蛋白。推测hpil3目标基因的突变导致编码蛋白不能与相关蛋白互作从而介导了下游抗病信号途径的激活。接种Xoo的疣粒野生稻产生的大量H2O2可诱导叶片内RCA与类囊体膜的结合。本研究发现接种Xoo会诱导疣粒野生稻发生H2O2的迸发,且氧化迸发的时间段和RCA从叶绿体基质向类囊体膜转移的时间段高度吻合,这暗示了二者存在某种关系。H2DCFDA染色试验发现生成的H2O2积累在叶片的叶绿体。进一步体外实验表明H2O2可诱导疣粒野生稻RCA的转移,且这种转移是疣粒野生稻特异的,混合疣粒野生稻和栽培稻大粒香得叶绿体组分不会发生这种转移。综上所述,本文利用基于二代基因组测序的图位克隆策略,克隆了并通过转基因功能互补确证了hpil3的目标基因,结果表明HPIL3的突变和功能缺失导致了水稻叶片类病变表型,既HPIL3负调控水稻叶片细胞程序性死亡和类病变表型;实时荧光定量PCR研究结果表明hpil3叶片多个抗病相关基因显著上调;蛋白质组学的研究表明HPIL3通过多种途径参与调节水稻类病变的形成;进一步通过酵母双杂交筛选获得了HPIL3的4个候选互作基因;疣粒野生稻可能通过核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(Rubisco activase,RCA)与类囊体膜的结合从而避免其受到激增的H2O2伤害,说明RCA除了我们通常所知的调节光合作用外也可能在疣粒野生稻抗Xoo中发挥作用。本研究为水稻抗白叶枯病机制的深入研究以及水稻抗病育种提供了重要的基因资源和前期理论基础。