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研究背景GATA4（GATA binding protein 4）是维持心脏发育的关键性转录因子,在心脏形态发生中发挥着非常重要的作用,同时也可以作为抗凋亡因子调控心肌细胞的存活。外泌体是细胞旁分泌单位的组成部分,可以部分复制其亲本细胞的特性并通过在细胞间传递来发挥机体修复作用。本课题旨在阐明GATA4对心脏成纤维细胞集落（c CFU-Fs）衍生外泌体的心脏保护作用的影响及其相关机制。第一部分GATA4+心脏成纤维细胞集落来源的外泌体的提取及鉴定目的:分离、纯化Sca-l+心脏成纤维细胞集落,观察缺氧对c CFU-Fs中GATA4表达的影响。慢病毒转染GATA4,提取GATA4+c CFU-Fs和NC-c CFU-Fs来源外泌体,并进行鉴定。方法:1)取野生型的C57BL/6小鼠的心脏,参照Tang（1）等人的方法获得心脏来源的成纤维细胞集落,待扩增培养充分后,先采用免疫磁珠筛选法去除含有造血细胞表面标记的细胞,再利用Sca-1磁珠进行二次分选获得Sca-1阳性c CFU-Fs,流式细胞仪分析细胞表型。2)建立细胞缺氧模型,RT-q PCR、Western-blot检测缺氧对c CFU-Fs中GATA4 mRNA和蛋白表达的影响。3)构建GATA4慢病毒载体以及negative control（NC）慢病毒对照载体,转染Sca-1+c CFU-Fs,利用细胞免疫荧光及Western-blot检测转染效率。4)超速离心法提取GATA4+c CFU-Fs和NC-c CFU-Fs外泌体,使用免疫电镜、纳米颗粒示踪分析法以及Western-blot对外泌体进行鉴定。结果:1)心肌组织充分消化、培养3周后组织块周围有大量“小,圆,亮”细胞聚集重叠生长,细胞团块数量较多时进行传代。显微镜下可见梭形细胞呈克隆样扩增。两次磁珠分选后,流式细胞仪检测c CFU-Fs的细胞表型。结果提示c CFU-Fs表面标记抗原Sca-1高度表达:92.10%,造血系特异性表面标记物呈阴性:CD34:2.44%,CD45:2.36%,由此我们获得了Sca-1+,CD34-,CD45-的c CFU-Fs。2)RT-q PCR、Western-blot结果表明,c CFU-Fs在缺氧24h后细胞内的GATA4表达明显降低。3)使用倒置荧光显微镜观察GFP-GATA4慢病毒感染c CFU-Fs的效率,结果显示c CFU-Fs的感染效率大于90%,Western-blot结果表明GATA4慢病毒转染后c CFU-Fs细胞内GATA4蛋白表达水平较阴性对照组明显升高。4)透射电镜显示超速离心法提取的外泌体是具有脂质双层膜结构的囊泡,Western-blot检测外泌体标记蛋白CD9、Alix及Tsg101表达呈阳性,Nanosight分析结果显示待测囊泡粒径位于50-200nm之间。结论:缺氧导致转录因子GATA4在cCFU-Fs中的表达下降。通过磁珠分选、纯化以及慢病毒转染,可以稳定获得GATA4阳性Sca-1+c CFU-Fs(c CFU-FsGATA4)和NC-Sca-1+c CFU-Fs(c CFU-FsNC)。利用超速离心法成功提取了c CFU-Fs来源的外泌体,建立了完善的Sca-1+c CFU-Fs体外培养和外泌体提取流程,获得了符合浓度、纯度要求的外泌体,为后续开展GATA4对c CFU-Fs旁分泌功能影响的相关研究打下了夯实的基础。第二部分GATA4+cCFU-Fs外泌体抑制细胞凋亡的体外和体内研究目的:观察cCFU-FsGATA4、cCFU-FsNC来源的外泌体对离体缺氧心肌细胞以及急性心肌梗死后心脏功能影响的不同。方法:1)用PKH26标记外泌体并与H9C2共孵育,激光共聚焦显微镜检测细胞对外泌体的摄取情况。建立H9C2缺氧模型,分别与NC-Exo和GATA4-Exo共孵育,CCK8及流式细胞仪检测两种外泌体对细胞增殖及凋亡的影响。2)将体重20g-25g的C57BL/6小鼠随机分为4组。AMI组予以心脏冠脉前降支（LAD）结扎。NC-Exo组、GATA4-Exo组分别在梗死区域周围注射c CFU-FsGATA4和c CFU-FsNC来源的外泌体。伪手术组操作除LAD结扎外,余与AMI组相同。术后24小时行TUNEL染色评估梗死区域细胞凋亡数量,Western-blot检测心肌组织中凋亡相关蛋白的表达。术后第28天予以多普勒超声检测心功能;术后28天处死小鼠,制备心脏石蜡切片,进行Masson染色观察梗死区域纤维化程度。结果:1)PKH26标记的外泌体与H9C2孵育12h后,免疫荧光镜下可见大量红色物质在胞浆聚集。CCK8结果提示,缺氧可以造成H9C2活力下降,与NC-Exo相比,GATA4-Exo共孵育可明显减少缺氧引起的细胞损伤。Western-blot结果显示,缺氧上调H9C2细胞中cleaved-caspase3（c-caspase3）的蛋白水平。NC-Exo、GATA4-Exo处理后,细胞内c-caspase3水平较对照组均有下降,其中GATA4-Exo的下调作用尤为明显。流式细胞凋亡检测结果表明,缺氧导致H9C2凋亡增加,H9C2与NC-Exo、GATA4-Exo共孵育后,缺氧诱导的细胞凋亡有所减少,且GATA4-Exo的抗凋亡作用更加明显。2)TUNEL染色结果发现LAD结扎导致心肌细胞凋亡增加,GATA4-Exo注射可以显著抑制心肌细胞凋亡,而NC-Exo的抗凋亡作用并不明显。Masson染色及心脏超声结果表明,GATA4-Exo比NC-Exo更有效的抑制心肌梗死后的纤维化程度及改善心梗后的心脏功能。结论:离体以及在体实验证明,与NC-Exo相比,GATA4-Exo的抗凋亡,抑制纤维化以及改善心功能作用更为明显。第三部分:离体水平探讨GATA4增强cCFU-Fs外泌体抗凋亡作用的机制目的:1)利用Affymetrix microRNA芯片,荧光素酶报告基因阐明GATA4过表达增强c CFU-Fs来源外泌体抗凋亡能力的相关分子机制。2)在离体水平通过在H9C2中转染miR221mimic、miR221inhibitor和si PTEN证实PTEN-PI3K/Akt通路参与了miR221介导的GATA4-Exo的抗凋亡作用。方法:1)构建NC-Exo、GATA4-Exo两种外泌体的Affymetrix miRNA 4.0芯片,获得原始数据,采用GO、Pathway等生物信息学处理,筛选其中有关细胞保护及抗凋亡的miRNAs,并利用RT-q PCR进一步验证芯片结果。2)利用miRNA靶基因预测工具Target Scan,miRanda,microRNA.ORG预测miRNA靶基因。RT-q PCR检测miRNA对靶基因表达的影响。采用双荧光素酶报告基因进行miR221与靶基因结合位点的检测。3)转染miR221 mimic和inhibitor,检测miR221对靶基因mRNA和蛋白的表达以及对缺氧H9C2细胞活力和凋亡的影响。4)建立H9C2细胞缺氧模型,分别予以GATA4-Exo、转染miR221 inhibitor和si PTEN处理:1利用RT-q PCR和Western-blot观察细胞内PTEN的表达;2利用CCK8和流式细胞仪检测细胞活力和凋亡情况;3Western-blot检测细胞内p-Akt,c-Caspase3的表达。结果:1)采用筛选标准为p<0.05,同时FC（abs）在2.0倍以上为具有显著性差异,芯片结果表明,与对照组NC-Exo相比,miR6538,miR2137,miR221,miR6968-5p等10个miRNA在GATA4-Exo中表达明显升高,而miR7651-3p,miR539-3p,miR345-5p,miR7025-5p表达下降。其中,经GO、Pathway预测miR221与细胞抗凋亡功能相关。RT-q PCR验证结果与芯片结果大致相同。2)通过靶基因预测软件,我们挑选了10个miR221可能的下游调控基因,RT-q PCR结果表明miR221mimic对p21,puma,DKK,Foxo3,PTEN,TIMP3,DDIT4均有抑制作用。我们聚焦PTEN作为miR221靶基因在GATA4-Exo抑制细胞凋亡功能的作用。为进一步验证PTEN3’非编码区含有miR221作用的位点,我们构建含有PTEN mRNA与miR-221结合的种子区域碱基突变的报告基因质粒并转染T293细胞,并进行荧光素酶活性检测。结果显示miR221mimic可抑制p GL3-PTEN-wildtype的表达,但对p GL3-PTEN-mutant的表达无影响。RT-q PCR和Western-blot结果表明miR221mimic可抑制PTEN在mRNA和蛋白水平的表达,而miR221inhibitor作用相反,提示PTEN是miR221直接作用的靶基因。3)CCK8以及流式细胞凋亡检测结果表明,与NC-mimic相比,miR221mimic可以显著缓解缺氧导致的细胞活力下降,同时抑制细胞凋亡;给予miR221 inhibitor可导致细胞活力进一步下降且细胞凋亡百分率增加。4)在细胞缺氧模型中:1缺氧刺激上调H9C2中PTEN mRNA和蛋白的表达。2CCK8与流式细胞检测结果表明,GATA4-Exo可以缓解缺氧导致的细胞活力下降和凋亡增加;miR221inhibitor的效应与缺氧刺激一致,可以导致细胞活力下降,凋亡增加;转染si PTEN的效应与GATA4-Exo相似,可部分逆转缺氧引起的细胞损伤。3Western-blot检测信号通路相关蛋白表达结果说明,H9C2缺氧后细胞内磷酸化Akt（p-Akt）水平下降,c-Caspase3水平升高,GATA4-Exo干预可以部分逆转缺氧引起的p-Akt和c-Caspase3表达变化,而miR221inhibitor的作用与GATA4-Exo相反,转染si PTEN后,p-Akt的表达较缺氧干预组明显增加,而c-Caspase3明显下降,其作用效果与GATA4-Exo一致。结论:GATA4过表达可以上调cCFU-Fs外泌体中miRNA221的表达,miRNA221通过抑制靶基因PTEN的表达,活化PI3K/Akt通路,下调caspase3,最终发挥抗凋亡作用。第四部分:在体验证miR221-PTEN-PI3K/Akt通路参与了GATA4-Exo的心脏保护作用目的:通过建立小鼠急性心肌梗死模型,验证GATA4-Exo对心脏功能的改善作用是由miR221-PTEN-PI3K/Akt通路所介导。方法:1)建立小鼠心肌梗死模型,梗死区周围分别注射PBS、GATA4-Exo、NC-Exo,模型建立24小时后,1利用RT-q PCR观察心肌组织中miR221的表达。2利用Western-blot检测心肌组织中PTEN和c-Caspase3的表达。2)建立小鼠心肌梗死模型,梗死区周围分别注射PBS、GATA4-Exo、NC-Exo、miR221 mimic,GATA4-Exo+miR221 inhibitor,24小时后处死小鼠,1TUNEL染色评估心肌凋亡水平;2Western-blot检测心肌组织中c-Caspase3表达;28天后处死小鼠,1心脏多普勒超声评估心脏功能;2Masson染色评估心肌纤维化程度;结果:1)（1）RT-qPCR结果表明,给予NC-Exo和GATA4-Exo后miRNA221表达升高,且GATA4-Exo组升高的程度更为显著;（2）Western-blot结果表明,注射GATA4-Exo可以下调心肌组织中PTEN和c-Caspase3的表达,NC-Exo对PTEN和c-Caspase3的抑制作为并不明显2)（1）TUNEL染色结果发现,注射GATA4-Exo和miR221mimic后,心梗造成的细胞凋亡明显减少,miR221 inhibitor可部分拮抗GATA4-Exo的抗凋亡作用。（2）Western-blot结果表明,与PBS和NC-Exo组相比,GATA4-Exo与miR221mimic均可下调c-Caspase3的表达,而GATA4-Exo与miR221 inhibitor共注射对c-Caspase3的抑制作用并不明显。（3）心脏超声结果表明,心肌梗死可以导致心脏功能下降,给予miR221mimic与GATA4-Exo干预相似,可以提高心梗后心脏的EF值和FS值;若同时注射GATA4-Exo+miR221 inhibitor,则可以部分削弱GATA4-Exo产生的心脏保护作用。（4）Masson染色结果表明,LAD结扎可导致心肌纤维化产生,GATA4-Exo和miR221mimic注射均可以降低心肌纤维化程度,miR221inhibitor可以拮抗GATA4-Exo产生的抑制纤维化作用。结论:动物实验表明注射GATA4-Exo可以使心肌内的miR221水平表达增加,进一步通过对其靶基因PTEN的抑制,最终减少心梗后心肌纤维化程度和改善心脏功能。