骨形成蛋白2在高血压来源血管平滑肌细胞老化及其钙化过程中的作用研究

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目的:研究骨形成蛋白2(BMP2)对体外培养的自发性高血压大鼠(SHR)胸主动脉平滑肌细胞(VSMCs)老化和钙化影响,探讨高血压动脉硬化及血管老化的机制。  方法:对12周龄的SHR和京都种正常血压大鼠(WKY)主动脉平滑肌细胞进行体外培养。从第三代细胞开始,根据培养液中是否加入重组人骨形成蛋白-2(rhBMP2)或重组鼠头蛋白(rmNoggin),分为SHR组、WKY组、SHR-rhBMP2组(BMP2组)和SHR-rhBMP2-rmNoggin组(BMP2+Noggin组)。其中BMP2组和BMP2+Noggin组为实验组,SHR组和WKY组为对照组。分别培养至第七代,应用细胞衰老β半乳糖苷酶染色、von kossa染色比较各组VSMCs衰老、钙化情况,运用免疫细胞化学染色及Western blot研究BMP2、Runx2、MGP的变化。  结果:⑴随着传代次数的增加,平滑肌细胞衰老程度逐渐加重。第5代细胞开始至第七代,WKY组较同期SHR组明显降低,差异有统计学意义(第五代P=0.031,第七代P=0.000)。说明SHR来源的平滑肌细胞较WKY来源的更易于老化。⑵随着传代次数的增加,平滑肌细胞钙化程度逐渐加重。在每代细胞WKY组均明显低于SHR组,差异有统计学意义(第三代细胞P=0.006,第五代细胞P=0.033,第七代细胞P=0.000)。说明SHR来源的平滑肌细胞较WKY来源的更易于钙化。⑶随着细胞传代次数的增加,平滑肌细胞中BMP2的表达逐渐增加。在同一传代时期内,免疫细胞化学染色结果显示SHR组表达均较WKY组多,差异有统计学意义(第三代细胞P=0.007,第五代细胞P=0.000,第七代细胞P=0.000)。说明来源于SHR的平滑肌细胞BMP2表达较WKY来源多。⑷BMP2组的老化程度从第5代就开始明显高于同时期的SHR组,差异有统计学意义(第五代P=0.002,第七代P=0.001)。BMP2+Noggin组老化程度在第5代时较同期SHR组明显降低,差异有统计学意义(第五代P=0.017,第七代P=0.001)。说明外源性BMP2对SHR来源的平滑肌细胞的衰老、钙化有促进作用,BMP2抑制剂 Noggin可减轻其衰老。⑸BMP2组的钙化程度从第3代就开始明显高于同时期的SHR组,差异有统计学意义(第三代细胞P=0.002,第五代细胞P=0.000,第七代细胞P=0.000)。BMP2+Noggin组钙化程度在第7代时较同期SHR组明显降低,差异有统计学意义(P=0.000)。说明外源性BMP2对SHR来源的平滑肌细胞的钙化有促进作用,BMP2抑制剂Noggin可减轻其钙化。⑹随着传代次数的增加,平滑肌细胞中MGP的表达逐渐减少。免疫细胞化学染色显示第七代时SHR组MGP表达较WKY组表达少,差异有统计学意义(P=0.000);BMP2组较SHR组少,差异有统计学意义(P=0.001);BMP2+Noggin组较同期SHR组多,差异有统计学意义(P=0.000)。说明随着传代的进行,MGP的表达逐渐减少,SHR来源的VSMCsMGP表达较少,外源性BMP2可减少MGP表达,BMP2抑制剂Noggin可增加MGP表达。⑺随着传代次数的增加,平滑肌细胞中Runx2的表达逐渐增加。免疫细胞化学染色显示在第七代细胞时,SHR组Runx2表达均高于WKY组,差异有统计学意义(P=0.001);BMP2组高于同时期SHR组,差异有统计学意义(P=0.000);BMP2+Noggin组低于SHR组,差异有统计学意义(P=0.004)。说明SHR来源的平滑肌细胞中Runx2表达多,外源性BMP2可增加其表达,BMP2抑制剂Noggin可减少其表达。  结论:SHR来源的主动脉平滑肌细胞较WKY来源的更易于老化、钙化,BMP2可促进SHR来源的主动脉平滑肌细胞老化和钙化,其机制可能与BMP2/Smads/Runx2信号通路以及抑制MGP表达有关。
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