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节瓜是我国特产蔬菜之一。随着生产面积的不断扩大和不可避免的连作,各种病害的发生日趋频繁,已严重威胁了节瓜生产的发展,因此培育节瓜抗病品种的任务迫在眉睫。培育转基因抗病品种将成为控制植物病害最经济最有效的途径。建立高效、稳定的再生系统是外源基因遗传转化成功的先决条件,但目前在节瓜离体培养中仍存在再生频率低、不定芽难以伸长等问题。本研究分析了植物生长调节剂、基因型、培养条件等因素对节瓜子叶离体培养的影响,在此基础上通过农杆菌介导法将从水稻中克隆的OsOxO1导入节瓜,探讨了预培养天数、农杆菌浓度、感菌时间、共培养时间等因素对转化效率的影响,旨在建立高效稳定的的节瓜离体培养体系和遗传转化体系。获得的主要结果如下:
1.分别以节瓜A39、A19、A02、A06、A12、A10、A14和B05的子叶为外植体,筛选出子叶分化频率较高的品种A39,其子叶再生频率可达到60%~70%。
2.以A39的子叶为材料,优化了节瓜子叶离体培养体系。适宜的外植体为暗培养3d见光1d无菌苗的子叶基部;接种方式为垂直插入;分化培养基为MS+6mg/LBA+0.2mg/L NAA;培养条件为接种后放到光下培养;不定芽伸长培养基为MS+3mg/LBA+0.2mg/L NAA;生根培养基为1/2MS+0.5mg/L IAA。
3.在优化再生体系的基础上探讨了预培养天数、农杆菌浓度、感菌时间、共培养时间等因素对农杆菌介导的转化体系转化效率的影响。结果表明将子叶基部在MS+6mg/L BA+0.2mg/L NAA上预培养3d,投入到OD600为0.4携带目的基因的含50μmol/L AS的农杆菌GV3101菌液中浸染10min,在芽诱导培养基上暗培养3d,转入筛选培养基MS+6mg/L BA+0.2mg/L NAA+30mg/L Gen+500mg/L Cef中可筛选到较多的抗性芽。将所得抗性芽转入伸长培养基中培养2周后,转入生根培养基中,共获得4株抗性株系。
4.转基因植株的检测。取4株抗性植株的叶片分别进行OxO活性和PCR检测,结果没有检测到OxO活性,但PCR检测获得一株为阳性,初步证明OsOxO1基因已整合到节瓜基因组中。