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目的:研究蟾蜍灵(Bufalin)对胶质瘤细胞生长和增殖的抑制作用,对人胶质瘤干细胞的抑制和诱导凋亡的作用及作用机制,并探究蟾蜍灵对替莫唑胺的敏感性的影响。材料与方法:取人胶质瘤U87MG、LN-229细胞和肝细胞LO2分别加入不同浓度的蟾蜍灵,细胞增殖抑制实验(MTT)检测蟾蜍灵处理24、48和72小时后,对细胞生存率的影响;克隆形成实验观察蟾蜍灵在不同浓度时对胶质瘤细胞增殖能力的影响;用低粘附的细胞培养板,无血清细胞培养基培养胶质瘤干细胞,倒置光学显微镜观察细胞形态;加入蟾蜍灵处理后观察干细胞形态变化及干细胞球体积和数量变化;PI荧光染色观察蟾蜍灵处理后的干细胞死亡情况;应用流式细胞术检测不同浓度蟾蜍灵处理后的胶质瘤干细胞凋亡情况;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测不同浓度蟾蜍灵处理后,胶质瘤干细胞的凋亡相关蛋白表达水平的变化;蟾蜍灵和替莫唑胺单独和联合处理细胞后,应用MTT、流式细胞术、Western blot检测胶质瘤干细胞增殖和凋亡情况。结果:1.MTT结果显示,不同浓度蟾蜍灵处理U87MG和LN-229细胞24、48和72小时后,细胞生存率明显下降。U87MG细胞在蟾蜍灵处理24、48和72h时的IC50分别为85.3,34.5和16.7 n M,LN-229细胞在蟾蜍灵处理24、48和72h时的IC50分别为184.2,96.1和32.7 n M。蟾蜍灵对肝细胞LO2的抑制作用不明显。U87MG和LN-229细胞的克隆形成结果显示,加入蟾蜍灵20n M的细胞克隆数明显低于10n M和对照组,并且在U87MG细胞的20n M组中,几乎看不到细胞克隆。2.U87MG和LN-229细胞可以成球,并且成球细胞的干细胞标志蛋白表达量明显比正常细胞高。蟾蜍灵处理后的胶质瘤细胞形成的干细胞球明显比对照组形成的小,且干细胞球数量也明显减少。干细胞形成后,蟾蜍灵处理组的细胞球明显变松散甚至周围出现细胞碎片。PI染色可以看到随着蟾蜍灵浓度的升高,胶质瘤干细胞死亡越多。蟾蜍灵处理后的胶质瘤干细胞,经流式细胞仪检测后发现凋亡比例明显比对照组高,并存在剂量时间依赖性,Western blot检测凋亡蛋白表达量同样增加;3.MTT检测蟾蜍灵和替莫唑胺(Temozolomide,TMZ)联合应用后的胶质瘤干细胞生存率明显低于单独用药组;流式细胞仪检测蟾蜍灵和替莫唑胺联合用药组的细胞凋亡比例,同样高于单独蟾蜍灵或替莫唑胺用药组;Western blot检测线粒体凋亡途径的促凋亡蛋白P-Bad和Cleaved-Caspase-9表达量升高,抑凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xl的表达水平明显下降。结论:1.蟾蜍灵抑制胶质瘤细胞生长和增殖,对肝细胞LO2几乎没有毒性作用。2.蟾蜍灵抑制胶质瘤干细胞活性并杀伤胶质瘤干细胞;蟾蜍灵可以诱导胶质瘤干细胞发生凋亡。3.蟾蜍灵提高胶质瘤干细胞对替莫唑胺的敏感性,其机制可能是上调促凋亡蛋白的表达,下调抑凋亡蛋白表达。