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研究背景角膜移植手术是目前治疗角膜盲最主要、最有效的复明手段,但术后发生免疫排斥反应仍然是导致移植失败的最主要原因。虽然免疫抑制剂可以抑制免疫排斥反应,但价格昂贵且毒副作用大,限制了它的长期使用。因此近年来对角膜移植免疫排斥反应的研究方向主要集中在诱导受体产生针对移植角膜的特异性免疫耐受。已知树突状细胞(dendritic cells,DC)具有诱导移植免疫耐受的作用,同时研究表明,核因子-κB(NF-κB)与DC发育成熟及抗原呈递功能的关键性调控基因的转录密切相关,p50/RelA是NF-κB最常见的二聚体,是其发挥生物学功能的最主要形式。因此,本研究欲通过低表达RelA基因从而下调NF-κB的转录活性,阻断DC的成熟,并经尾静脉注射该DC回输给受体,通过建立大鼠同种异体角膜移植模型,观察其在角膜移植免疫反应中的作用,以期为角膜移植免疫耐受提供新的理论和实验依据。目的探讨低表达RelA基因的树突状细胞在大鼠角膜移植免疫反应中的作用。方法(1)应用GM-CSF和IL-4体外培养、诱导分化供体大鼠骨髓源性DC,结合细胞形态、表型及功能加以鉴定。(2)应用高效抑制RelA表达的shRNA序列,行慢病毒包装并感染未成熟DC(命名为RelA-DC),同时设立阴性对照病毒感染DC组(命名为SiNC-DC)及未感染慢病毒DC组(命名为Control-DC),分别给予1μg/ml的脂多糖刺激,利用RT-qPCR、Western Blot检测DC中RelA基因表达;流式细胞仪分析DC表型;ELISA检测DC上清IL-12和IFN-γ含量;MLR检测DC刺激T淋巴细胞增殖的能力。(3)以SD大鼠为供体、Wistar大鼠为受体,建立大鼠同种异体角膜移植模型60例,随机分成PBS组、mDC组、imDC组和RelA-DC组(n=15),分别于移植前7天经尾静脉注射1ml PBS、mDC(5×106个)、imDC(5×106个)和 RelA-DC(5×106个);术后观察角膜植片的存活时间并评分;第14天取角膜植片行HE切片观察、通过RT-qPCR检测Th1型细胞因子(IL-2、IFN-γ)和Th2型细胞因子(IL-4、IL-10)的mRNA表达水平,取脾脏通过流式细胞仪检测CD4+CD25+Treg、CD4+FoxP3+Treg的阳性表达率及通过MLR观察受体脾脏T细胞对供体抗原刺激的反应能力。结果(1)经形态学、表型和功能学鉴定,证实所培养细胞为DC。(2)RelA-DC的RelA基因转录水平和蛋白表达水平明显低于SiNC-DC、Control-DC(P<0.01);其表面分子(MHC Ⅱ、CD80、CD86)的表达水平、刺激 T淋巴细胞增殖能力及上清液细胞因子IL-12、IFN-y水平亦低于SiNC-DC、Control-DC(P<0.05)。(3)RelA-DC组大鼠受体脾脏T细胞对供体抗原刺激的反应能力、Th1型细胞因子水平低于PBS组,mDC组和imDC组(P<0.05),而角膜植片的存活时间、Th2型细胞因子水平、CD4+CD25+Treg及CD4+FoxP3+Treg阳性表达率高于PBS组,mDC组和imDC组(P<0.05)。结论输注低表达RelA基因的DC能抑制大鼠角膜移植术后免疫排斥反应,明显延长角膜植片的存活时间,可能主要通过抑制T细胞增殖反应、诱导Th1/Th2偏移以及CD4+CD25+Treg和CD4+FoxP3+Treg的扩增参与免疫耐受的形成。