论文部分内容阅读
真菌疏水蛋白是一种具有特殊结构和活性的小分子蛋白，由高等丝状真菌在特定时期分泌产生，大小在10kDa左右。单体通过自组装可以获得很强的表面活性，可以改变材料表面的亲水/疏水性质。这种蛋白质存在于食用菌中，是无毒性的，可以作为纯天然的表面活性剂用于改善食品抗相变能力，延长食品保质期和保鲜期，还可以用于药品和医疗器械的包被，有很好的研究和应用价值。 疏水蛋白Po.HYD1，是本实验室从食用菌糙皮侧耳（Pleurotus ostreatus）中分离鉴定出的一种I型疏水蛋白，结构稳定，不能被热的SDS分解，只能被甲酸或三氟乙酸解离，在糙皮侧耳的生长和发育阶段起着重要的作用。研究表明， Po.HYDl可以降低水表面张力，并且通过自组装形成的膜可以逆转改变石英，特氟龙等材料的表面疏水/亲水性质，具有高度的表面活性。但是，由于糙皮侧耳菌丝体的生长周期比较长，菌丝体的生长量也比较少，不适于大规模的进行疏水蛋白的提取，限制了糙皮侧耳疏水蛋白的研究和应用。 本研究首先从糙皮侧耳 Pm039菌丝体中提取总 RNA，根据本试验室在 NCBI上发表的Po.hyd1基因序列，设计合成特异性引物，并分别在上游引物5′端和下游引物5′端分别加入两个酶切位点：EcoR I和保护碱基（CG），Not I和保护碱基（AAA），应用RT-PCR技术扩增得到了编码糙皮侧耳疏水蛋白Po.HYD1的基因，序列大小为407bp。然后，通过TA克隆将目的基因连接到PMD-18T载体上，经过一系列的鉴定和测序分析表明，试验中克隆得到的目的基因与NCBI发表的基因cds序列同源性达到100％。 对含有重组质粒PMD-18T-Po.hyd1的大肠杆菌DH5α培养，提取载体质粒，与表达载体pPIC9k同时用EcoR I和Not I进行酶切，得到Po.hyd1基因片段与酶切后的表达载体进行连接，构建出pPIC9k-Po.hyd1载体，经过一系列的鉴定和测序分析证明转入的目的基因序列正确无误后，用 Sac I线性化，通过电转化转入毕赤酵母GS115细胞中。在MD平板上培养筛选出HIS+转化子，然后通过抗生素G418筛选，在3mg/mL的浓度下筛选到两个高拷贝的转化子，用1%甲醇诱导表达，表达产物分泌到培养基中。 由于影响毕赤酵母生长和表达的因素比较多，为了达到最好的表达效果，对这些因素用响应面分析的方法进行了优化。在进行响应面分析之前，通过单因素试验确定了其中两个因素的最佳值，对剩余的3个因素进行响应面分析，得到最佳条件：YNB用量20.0mL/L，摇床转速225r/min，甘油浓度20.5 mL/L，初始pH值5.8，酵母提取物8.2g/L。同时对毕赤酵母工程菌最佳表达时间进行了优化，经过SDS-PAGE电泳分析，96h时疏水蛋白的表达量最高。使用得到的最佳条件进行发酵后，经过一系列的提取纯化步骤得到糙皮侧耳疏水蛋白的固体粉末纯品，经过计算，表达量达到60mg/L，大大高于从糙皮侧耳菌丝体中提取疏水蛋白的产量。 对表达的重组蛋白进行分离纯化后，进行了SDS-PAGE电泳分析，红外光谱分析，表明样品为蛋白质，纯度较高，分子量大小在15kDa左右，与天然糙皮侧耳疏水蛋白Po.HYD1相同。用重组Po.HYD1制成水溶液，对疏水材料和亲水材料进行改性后，进行水接触角的检测，结果表明重组疏水蛋白可以使材料的疏水亲水性发生逆转，说明重组疏水蛋白仍然具有天然疏水蛋白的活性。