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Toll受体首先在果蝇中报道,研究发现其在果蝇的胚胎发育和天然免疫中发挥作用。后来,在脊椎动物中发现与果蝇Toll受体结构相似的蛋白,命名为Toll样受体(TLRs)。TLRs在天然免疫中起着重要作用,并且能够激活适应性免疫,是联系天然免疫和适应性免疫的桥梁。髓样分化因子88(MyD88)作为白介素Ⅰ受体/Toll样受体超家族信号通路中的一员,是TLRs信号通路中的一类重要接头分子。本研究以鲤鱼为研究对象,采用分子克隆和SMART RACE技术获得鲤鱼TLR22 cDNA全长,并分析了其在有关组织中的分布情况;通过鳗弧菌刺激实验,real-time PCR技术检测TLR22基因和MyD88基因(本实验室已经克隆)mRNA表达水平的变化;在体外将TLR22的部分编码序列连接到pET-28a(+)表达载体上,而后转化大肠杆菌BL21(DE3),利用表达的外源蛋白制备抗原,免疫新西兰雄兔,得到抗血清,蛋白质印迹显示所得到的抗血清能够与抗原发生特异性结合。获得结果如下:(1)TLR22 cDNA序列全长3325bp,其中5’-UTR为56bp,3’-UTR为431bp,ORF长2838bp。TLR22基因编码的蛋白质由945个氨基酸组成,其分子量为108.24kDa、pI为8.733。TLR22具有LRR结构域受体亚家族的共同特征,胞外区含740个氨基酸残基,包括16个LRR结构域;胞内区含172个氨基酸残基,具有典型的TIR结构域;此外,还具有23个氨基酸的跨膜区和22个氨基酸的信号肽序列。(2)TLR22和MyD88基因mRNA在健康鲤鱼所选组织中为非组成性表达,在后肠、脾脏、肾脏、鳃和口腔上皮中表达量较高,在前肠和皮肤中表达量较低,而在肌肉中未检测到其表达。氨基酸结构分析、多序列比对和进化树分析都表明,TLR22与其他物种TLRs之间有较高的氨基酸相似性,其中,与金鱼TLR22的同源性最高(达88.6%)。采用鳗弧菌刺激鲤鱼0、0.5、1、3、5、7天,real-time PCR检测表明TLR22基因和MyD88基因mRNA在前肠、后肠、鳃和皮肤中的表达均有不同程度的上调,揭示TLR22和MyD88在鲤鱼粘膜免疫中发挥着重要的作用。(3)以鲤鱼鳃cDNA为模板,利用RT-PCR扩增得到TLR22的部分编码序列,经EcoRⅠ、HindⅢ双酶切后连接入pET-28a(+)原核表达载体中。将重组质粒转化大肠杆菌表达菌BL21(DE3),用1mM的IPTG诱导目的蛋白表达。SDS-PAGE结果显示,重组菌经IPTG诱导后表达融合蛋白,其分子量为38.17kDa。进一步实验分析表明,在37℃条件下经1mM IPTG诱导6h时蛋白表达量最大,表达的蛋白大部分是以包涵体的形式存在的。对包涵体蛋白进行初步纯化后,制备抗原免疫动物,收获抗血清,并利用得到的抗血清进行琼脂双向扩散以及蛋白质印迹。经琼脂双向扩散测得抗血清的效价为1:4,蛋白质印迹显示所得到的抗血清能够与抗原发生特异性结合。