海南粗榧紫杉醇生物合成的调控

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海南粗榧(Cephalotaxus mannii)是三尖杉科(Cephalotaxaceae)分布最南的种,也是国家二级稀有濒危重点保护植物。其树皮、茎、叶和种子中含有含量丰富的、具有抗癌活性的三尖杉酯碱类物质,具有很高的经济价值,一直以来都是研究的热点。本研究首次发现海南粗榧中还富含具有抗癌活性的次生代谢产物一紫杉醇。并利用诱导子模拟不同逆境,以二年生实生苗茎、叶为材料,研究紫杉醇合成相关基因的表达、调控特征。为海南粗榧基因资源的挖掘以及人工诱导紫杉醇生物合成提供理论参考。主要结论如下:(1)通过叶绿素荧光技术,最终测得经外源诱导刺激海南粗榧叶片后,荧光动力学参数调节性能量耗散Y(NPQ)和非调节性能量耗散系数Y(NO)均受到影响,说明通过外源物质可以在海南粗榧中模拟胁迫发生。(2)首次在海南粗榧中建立了紫杉醇HPLC检测方法,并通过测试发现海南粗榧中富含抗癌活性物质紫杉醇和其前体物质巴卡亭Ⅲ。通过利用MeJA(100μM)诱导海南粗榧叶片,最终测得紫杉醇和巴卡亭IH含量经逆境胁迫刺激后明显上升。(3)利用同源克隆技术获得了GGPPs和TAT基因片段,并通过RACE技术获得海南粗榧GGPP合成酶cDNA基因全长为1694bp(GenBank登录号:JX971119),并对该基因进行生物信息学分析。(4)利用Real Time PCR技术,通过MeJA(100μM)、Flg22(1μM)、Harpin(50mg/mL)三种不同诱导子模拟逆境刺激海南粗榧茎段、叶片。发现茎叶中参与紫杉醇合成途径相关基因GGPPs和TAT,均发生基因表达上调,但上升的速度和幅度不同。(5)建立了海南粗榧基因组DNA甲基化敏感扩增多态性(MSAP)分子标记的方法。发现通过模拟逆境胁迫刺激后,海南粗榧基因组总甲基化率降低,发生去甲基化现象。
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