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来自嗜热栖热菌 HB8（Thermus thermophilus HB8,ATTC27634）的 4-α-糖基转移酶（4-α-glycosyltransferase,简称 4αGTase 或 4GT,EC 2.4.1.25）作用于淀粉,可断裂其α-1,4糖苷键,形成新的α-1,4糖苷键,致其直链淀粉或支链淀粉的主链被分解,而支链淀粉的侧链长度将延长。与天然淀粉相比,这种被4GT改性过的淀粉,其回生特性得到改善,抗消化性得到提高,溶解性也增加,并且具有热可逆凝胶特性。这些性质提示4GT在食品、化妆品和医药等领域有较大的应用前景。目前,国内对于4GT的研究还处于实验室研究阶段,且酶活普遍较低,纯化困难,限制了其工业应用。本研究旨在将嗜热栖热菌HB8的4GT在大肠杆菌中进行高酶活的分泌表达,并探究4GT的酶学性质。主要研究结果如下:（1）4GT在大肠杆菌中的分泌表达:借助载体pET-32a（+）,分别构建了表达单个4GT基因的工程菌pET32a-4GT/BL21（DE3）与两个4GT基因串联表达的工程菌pET32a-4GT-4GT/BL21（DE3）。结果显示,两株基因工程菌均分泌表达了 4GT。在IPTG诱导下,对于总酶活,菌株 pET32a-4GT/BL21（DE3）为 153.73 U/mL,菌株 pET32a-4GT-4GT/BL21（DE3）为174 U/mL,前者比后者低了 13.19%;对于胞外酶活,菌株pET32a-4GT/BL21（DE3）为 90.62U/mL,菌株 pET32a-4GT-4GT/BL21（DE3）为 86.76U/mL,两者无显著性的差异;对于胞内酶活,菌株pET32a-4GT/BL21（DE3）为63.11 U/mL,菌株pET32a-4GT-4GT/BL21（DE3）为 87.24U/mL,前者比后者低了 38.23%。在无 IPTG 诱导下,菌株 pET32a-4GT/BL21（DE3）的本底酶活为 8.1 U/mL,菌株 pET32a-4GT-4GT/BL21（DE3）的本底酶活为43.71 U/mL,前者比后者低了 4.40倍,且两者的本底酶活均来源于胞内。综合考虑,工程菌应具有低的本底酶活,菌株pET32a-4GT/BL21（DE3）的表达系统优于pET32a-4GT-4GT/BL21（DE3）菌株。（2）4GT酶学性质探究:选取菌株pET32a-4GT/BL21（DE3）进行诱导表达4GT,通过镍亲和层析纯化制备了 4GT样品,纯化后的4GT 比酶活为438.06 U/mg。并探究了 4GT的酶学性质。结果显示,4GT在pH7.0、反应温度为60℃时有相对最佳酶活力。其中,在pH6.0-8.0范围内稳定,4GT的残余酶活力可维持在70%以上;在温度为30℃-60℃时,4GT的剩余酶活性可维持在70%以上,表明4GT的温度耐受范围相对较广。在金属离子中,Mg2+,K+,Na+,Ba2+,Fe3+和Sn2+对4GT酶活有最显著的促进作用;Co2+,Mn2+和Ca2+对4GT酶活有促进作用。而Cd2+和Zn2+对4GT酶活有明显的抑制作用,经处理后的4GT酶活力几乎丧失。4GT对含支链的淀粉有明显的催化功能,如玉米淀粉,小麦淀粉,豌豆淀粉、马铃薯淀粉等。其中,以1%的马铃薯淀粉作为底物时,4GT的相对酶活力为最高,且被4GT作用后的马铃薯淀粉的水溶性明显提高。通过HPAEC-PAD实验可知,4GT能延长马铃薯淀粉的支链长度,这证实了 4GT对淀粉的支化功能。（3）发酵条件的优化:通过对pET32a-4GT/BL21（DE3）菌株的培养基种类、培养基初始pH、培养温度、接种量、装液量、诱导时间和IPTG浓度进行优化。结果显示,pET32a-4GT/BL21（DE3）菌株在30 mL的TB培养基中（pH7.0）,以5%的菌液接种量,以0.5 mmol/L IPTG为诱导物,在37℃诱导表达9h时,有相对最高的菌体生长密度、蛋白表达量及酶活。其中,菌体OD600值从3.58增至8.85,菌体生长密度提高了 1.47倍;菌株胞外蛋白由35.44mg/L增至278.17mg/L,蛋白产量提高了 6.85倍;菌株胞外4GT酶活由91.65 U/mL增至167.67 U/mL,酶活提高了 82.73%;全菌4GT酶活由140.32 U/mL 增至 210.45 U/mL,酶活提高了 49.98%。（4）诱变育种:通过4GT催化后的淀粉,遇碘显紫色的现象,可根据菌株周围紫色圈的有无及菌株间紫色圈与菌落直径比的显著性差异,来判断菌株的胞外是否分泌4GT及各菌株间胞外酶活的相对大小,建立分泌4GT菌株的高通量平板初筛方法。通过一轮易错PCR法和两轮亚硝酸钠诱变法,对4GT基因及其质粒进行随机诱变,并在大肠杆菌中进行高产菌株的选育。借助高通量平板初筛的方法,并在初始的发酵培养条件下,结合48孔板与摇瓶的复筛,最终获得胞外最高酶活为133 U/mL的诱变菌株,比出发菌株的胞外酶活提高了 46.77%;在优化的发酵培养条件下,该突变体的胞外酶活为 254.78 U/mL。综上所述,本研究实现了 4GT在大肠杆菌中的胞外分泌表达,简化了 4GT的制备流程,减少了杂蛋白对4GT活性的影响;探究了 4GT的酶学性质与4GT对淀粉的催化作用,为4GT的理论研究及淀粉的改性研究提供理论参考;建立了高通量平板初筛的方法,为今后诱变菌株的大量初筛减少工作量;获得了高效分泌4GT的重组菌,对于推动4GT的工业化应用有重要意义。