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拟穴青蟹（Scylla paramamosain）是我国重要的经济水产品,因味道鲜美、营养丰富而广受人们喜爱,但其经烹饪后仍然存在的热稳定致敏原是引发青蟹过敏问题的重要因素之一。因此,获得热稳定致敏原的基因序列,表征青蟹热稳定致敏原的理化性质及免疫学性质,定位热稳定致敏原的抗原表位,并在此基础上制备热稳定致敏原的低致敏性衍生物,对系统了解青蟹热稳定致敏原、蟹类致敏原特异性免疫治疗的生物制品研发、指导低致敏青蟹产品的加工生产具有重要意义。本研究首先利用蟹类过敏患者血清池筛查蒸制青蟹肌肉粗提物的热稳定致敏原,发现38 k Da与18 k Da的蛋白条带具有IgE结合能力。对两个目标蛋白进行纯化,经质谱鉴定为青蟹原肌球蛋白（tropomyosin,TM）与肌球蛋白轻链（myosin light chain,MLC）。随后,对TM与MLC进行克隆表达,获得TM的序列包含852 bp,编码284个氨基酸,MLC的序列包含459 bp,编码153个氨基酸;表达的重组蛋白与天然蛋白具有相似的二级结构、Ig G/IgE结合能力,且重组蛋白能够显著上调蟹类过敏患者嗜碱性粒细胞表面CD63与CD203c的表达。进一步分析热稳定致敏原与177份蟹类过敏患者血清IgE的特异性结合能力,结果显示TM、MLC与血清IgE的结合频率分别为32.8%、11.9%。基于以上研究结果,青蟹TM和MLC被世界卫生组织/国际免疫学会联合会过敏原命名小组分别命名为Scy p 1与Scy p 3。采用生物信息学技术、噬菌体展示技术、一珠一化合物肽库淘选技术,系统分析青蟹TM、MLC的模拟线性表位和模拟构象表位。利用合成肽技术结合抑制性Dot blot鉴定得到TM的10条IgE线性表位(A59-L70、A76-R90、R100-T110、L113-R125、M126-E139、R140-Y162、E163-D175、L176-S188、K189-V210、G211-Y231)与MLC的7条IgE线性表位(A7-G24、D35-E50、K51-K61、M62-F87、K96-E106、L107-P125、D135-K147),分析鉴定出较强IgE结合能力的5条线性表位(TM:R100-T110、L113-R125;MLC:K51-K61、K96-E106、D135-K147)。与此同时,将TM与MLC的模拟构象表位关键氨基酸突变为丙氨酸,获得IgE结合能力显著降低的TM的突变体（K12A、E164A、Y267A）与MLC的突变体（C36A、V52A、D66A、K77A、N99A、I110A、P141A）,从而验证了TM的3个IgE构象表位与MLC的7个IgE构象表位,分析发现TM突变体（K12A、E164A）和MLC突变体（C36A、N99A）的IgE结合能力下降更为明显,提示这些关键氨基酸所在的4个构象表位为TM、MLC的重要表位。在本文鉴定出较强IgE结合能力的5条线性表位的基础上,采用基因工程技术删除线性表位分别获得2个突变衍生物（mt ALLERGEN）;通过碘乙酰胺分别修饰2个野生型致敏原（wt ALLERGEN）、2个突变衍生物（mt ALLERGEN）,获得4个破坏空间结构的还原烷基化衍生物（red/alk-wt ALLERGEN、red/alk-mt ALLERGEN）;分析发现,以上6个衍生物中的mt ALLERGEN和red/alk-mt ALLERGEN的IgE结合能力、嗜碱性粒细胞激活能力均显著低于red/alk-wt ALLERGEN,说明结构破坏的wt ALLERGEN致敏性无明显变化,提示在TM、MLC中占主导的IgE表位类型为线性表位。进一步评估mt ALLERGEN在小鼠体内的致敏能力,与wt ALLERGEN相比,发现mt ALLERGEN引发轻微的肠道炎症,显著降低淋巴细胞中辅助性T（T-helper,Th）细胞和B细胞的数量,显著减少特异性IgE、组胺、肥大细胞蛋白酶、白细胞介素-4的产生,并显著上调白细胞介素-10及特异性Ig G抗体的水平,提示mt ALLERGEN在体内使Th1和Th2细胞趋于平衡状态,进而减轻小鼠食物过敏症状。同时,mt ALLERGEN免疫Balb/c小鼠与新西兰大白兔后产生的特异性Ig G抗体,在体外均能有效阻断TM、MLC与患者血清IgE的结合,表明低致敏性衍生物诱导产生的特异性Ig G抗体具有阻断能力。综上,本研究克隆得到青蟹热稳定致敏原的基因序列,表达获得与天然蛋白具有相似性质的重组蛋白,深入分析了热稳定致敏原的IgE结合频率,获批世界卫生组织/国际免疫学会联合会过敏原命名小组的系统命名;综合3种表位分析技术定位了热稳定致敏原TM的10条IgE线性表位与3个IgE构象表位,MLC的7条IgE线性表位与7个IgE构象表位,鉴定了具有较强IgE结合能力的表位;确定了热稳定致敏原与血清IgE结合占主导的表位类型为线性表位,采用基因工程技术删除较强IgE结合能力的5条线性表位,以获得2个低致敏性衍生物,明确了低致敏性衍生物在小鼠体内使Th1和Th2细胞趋于平衡状态,且诱导产生的特异性Ig G抗体在体外具有阻断能力。这些结果可为蟹类过敏的组分诊断提供技术支持,也为蟹类致敏原特异性免疫治疗生物制品的开发奠定理论基础。