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研究目的:1.观察线粒体分裂对线粒体相关内质网膜(MAMs)结构及功能的影响;2.探讨MAMs对肝癌细胞生长的影响;3.分析线粒体分裂通过Rab32对MAMs结构及肝癌细胞生存的影响。研究方法:1.利用透射电子显微镜观察肝癌与癌旁组织中MAMs数量的变化;利用Kaplan-Meier曲线分析MAMs数量与肝癌患者预后的关系;通过脂质体转染法构建Drp1干涉/过表达细胞株,利用Western blot和激光共聚焦显微镜观察转染效果;利用Cell light?ER-RFP和Mitotacker Green染料分别标记内质网和线粒体,通过超高分辨率显微镜观察过表达Drp1后线粒体与内质网的共定位情况,利用Rhod-2染料检测过表达Drp1对线粒体内Ca2+浓度的影响;2.通过脂质体瞬时转染法构建PACS-2干涉的细胞株,利用Western blot观察干涉效果,并利用电镜观察干涉PACS-2后对MAMs结构的影响,进一步通过EDU和流式细胞术,检测干涉PACS-2对肝癌细胞增殖和凋亡的影响;3.利用Percoll离心法分离亚细胞结构,通过Western blot检测这些细胞器的标记蛋白,验证MAM组分的提取纯度,并将得到的MAMs组分蛋白运用非标记液相色谱串联质谱的蛋白质组学技术进行检测,筛选出影响MAMs形成的蛋白质;构建Rab32分子的表达载体,利用脂质体转染法对肝癌SNU-739 Drp1过表达细胞进行转染,通过Western blot筛选出构建成功的细胞株,利用透射电子显微镜观察在Drp1过表达的细胞中,过表达Rab32后MAMs结构的变化情况,并利用Rhod-2染料检测其对细胞内线粒体Ca2+的影响,进一步利用EDU和流式细胞术分析对肝癌细胞增殖和凋亡的影响。研究结果:1.肝癌组织中MAMs数量显著减少,Kaplan-Meier曲线分析发现数量越少预后越差;Drp1过表达抑制线粒体与内质网的共定位,降低线粒体内Ca2+浓度;2.干涉PACS-2可抑制MAMs结构的形成,促进肝癌细胞的增殖、抑制肝癌细胞凋亡;3、通过鉴定发现我们提取的MAMs组分蛋白具有较高的纯度;质谱共检测得到3043种蛋白质,其中190种蛋白质具有显著的差异变化(以倍数变化大于2倍且p<0.05)。对差异蛋白进行亚细胞定位和功能等分析,筛选出Rab32分子作为进一步研究对象;成功构建Rab32表达载体,发现在Drp1过表达细胞中过表达Rab32可促进MAMs结构形成,线粒体内Ca2+浓度增加,可抑制肝癌细胞的增殖,而促进肝癌细胞的凋亡。结论:本研究初步揭示了线粒体分裂对线粒体-内质网相互作用的影响及调控肿瘤细胞生存的潜在分子机制,为线粒体分裂促进肝癌细胞增殖的分子机制提供更多的证据,也为寻找Drp1基因相关的肝癌的分子靶标提供了新思路。