猪链球菌（Streptococcus suis, S. suis）是一种革兰氏阳性兼性厌氧菌,根据荚膜多糖（capsular polys-accharide, CPS）抗原特性差异,可将其分为35种血清型（1-34型,1/2型）。其中以猪链球菌2型（S. suis serotype 2, SS2）分布最广,致病性最强。人感染SS2后,通常出现化脓性脑膜炎、心内膜炎、伴有耳聋、运动功能紊乱等症状。1998年和2005年我国暴发的猪链球菌疫情出现了典型的链球菌中毒性休克综合征（STSS）临床症状,其发病急、病程短及高致死率等特点引起了国内外学者的广泛关注。目前对猪链球菌,尤其是我国猪链球菌流行株了解甚少,缺乏对猪链球菌毒力因子和致病机制的全面了解。虽然有几类毒力因子已被确认与猪链球菌的致病性相关,如具有抗吞噬作用的荚膜多糖（CPS）、胞外因子（EF）、溶菌酶释放蛋白（MRP）、溶血素（SLY）、精氨酸氨基肽酶（ADiS）等。国内外还鉴定出了一些可能的毒力因子,但多涉及毒力相关因子的功能性鉴定。由于不同菌株所具有的毒力因子各不相同,同一种毒力因子在不同菌株中的作用也不一定相同,同时单独研究毒力因子的功能并不能深入解释SS2的致病机制,因此研究这些毒力因子在SS2致病过程中是如何受到调控并共同发挥作用将更为重要。二元调控系统（two-component signal transduction system, TCSTS）是细菌在特定的环境下维持生存的一种重要的调控机制。细菌感染宿主的过程,是各个毒力相关基因在调控系统的复杂有序的调节下,共同发挥作用完成的。二元调控系统能够感应特定的外界信号,介导特定基因的表达,是细菌调节自身功能和毒力的中枢系统。我国猪链球菌强致病株05ZYH33中存在13个TCSTS和2个孤儿反应调控因子。猪链球菌05ZYH33的二元调控系统2148hk/rr是根据其编码基因所在阅读框的位置命名而来的。经同源性比对发现,该调控系统与产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens, C.perfringens）VirR/S的氨基酸序列一致性为30%。因此,本研究以二元调控系统2148hk/rr为研究对象,分析其在猪链球菌05ZYH33全基因组中的调控作用。二元调控系统2148hk/rr基因敲除突变株△2148hk/rr在菌落形态上和野生株相比无显著变化,但是生长速度略微缓慢。Hep2细胞黏附实验显示,突变株的黏附能力和野生株相比显著降低。体外全血杀伤实验也证实突变株更容易被其中的免疫细胞杀伤。腹腔注射CD1小鼠和耳缘静脉注射40日龄仔猪竞争感染实验表明,突变株在动物体内无法增殖,且表现出在血液中被清除的迹象,和体外的全血杀伤实验结果基本一致。细胞和动物实验从体外、体内两方面均证实突变株△2148hk/rr毒力下降。DAN芯片转录谱数据显示突变株△2148hk/rr共有426个基因在转录水平发生变化（2倍以上）,占全基因的19.42%,其中上调基因256个,下调基因170个。其中二元调控系统2148hk/rr能够对参与荚膜多糖合成的基因簇进行正向调控,2148hk/rr基因敲除后,与CPS合成相关的14个开放阅读框SSU05₀564-0577均发生了转录水平的下调,这些基因簇的变化使得突变株△2148hk/rr的荚膜明显变薄,荚膜的部分缺陷是突变株更易被鼠巨噬细胞吞噬以及在血液中快速被清除的主要原因。二元调控系统2148hk/rr还能够参与糖类、氨基酸、核苷酸、无机离子的代谢调节以及DNA的合成、修复等,基因敲除2148hk/rr后引发了胞内的代谢失衡。DAN芯片转录谱数据显示,2148hk/rr基因敲除后,猪链球菌05ZYH33中其它5个二元调控系统SalK/R、CiaR/H、YycF/G（SSU05₁358-1360）、1596hk/rr（SSU05₁595-1596）、0884hk/rr（SSU05₀883-0884）均发生了转录水平的下调,说明这些调控系统受到二元调控系统2148hk/rr的正向调控。为了进一步确定比较转录谱实验数据的可靠性,鉴定二元调控系统2148hk/rr的调控元,筛选出可能受2148hk/rr直接调控的45个基因,进行实时定量RT-PCR验证。结果显示两者之间具有显著的相关性（R2 = 0.926）,两种方法检测的45个基因的转录变化基本趋势一致。随后对二元调控系统2148hk/rr调控靶基因进行操纵子预测,筛选其中6个操纵子进行凝胶阻滞实验（EMSA）验证:SSU05₀564-0577,SSU05₀578-0581,SSU05₀624-0628,SSU05₁094-1095,SSU05₁216-1221,SSU05₁778-1780。体外EMSA实验显示,2148rr调控蛋白不能直接与基因SSU05₁403、以及其余6个操纵子首基因的启动子区结合,因此认为二元调控系统2148hk/rr对以上基因行使间接调控功能。对猪链球菌05ZYH33中其它7个调控系统SalK/R、CovR、RevS、CiaR/H、LuxS、1910hk/rr、1661hk/rr分别进行DNA芯片转录谱分析,按照COG功能分类对所有DNA芯片转录谱数据进行聚类,综合8个调控系统的聚类结果,发现二元调控系统2148hk/rr是荚膜形成中的主要调控系统,而其它调控系统1661hk/rr、CiaR/H、1910hk/rr、SalK/R只是对荚膜多糖合成过程中某几个基因进行调控,并不能产生表型上的影响。另外CiaR/H和1910hk/rr对参与氨基酸、核苷酸转运和代谢,细胞外膜合成的相关基因拥有相似的调控范围和调控趋势。同时还发现主要参与应激应答的二元调控系统CiaH/R是89K毒力岛的一个负向全局调控系统。通过聚类分析还发现编码溶血素的基因SSU05₁403（sly）在突变株SalK/R、CiaR/H、CovR、2148hk/rr中,均发生转录水平的上调,其中2148hk/rr、SalK/R、CiaR/H基因敲除后毒力减弱,而CovR已证实敲除后毒力增强,说明二元调控系统突变株中sly转录水平的上调并不能完全导致突变株毒力的增强,二元调控系统突变株毒力的变化,是多个毒力因子转录水平变化后平衡的结果,这也从另一个角度凸显了猪链球菌毒力因子存在着的复杂性和多样性。