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中医外科学中将下肢静脉性溃疡称为臁疮、裤口毒、裙边疮,现代医学将下肢静脉性溃疡(venous leg ulcer,VLU)定义为发生于下肢静脉倒流性疾病及静脉回流障碍性疾病后期常见的一种临床表现,是指病位发生于小腿下1/3胫骨嵴两侧、足踝部、足背皮肤和肌肉之间的慢性溃疡[1]。临床上一般将超4周而无明显愈合倾向的创面称之为慢性难愈性创面,早在2000多年前,希波克拉底的著作中就出现了对下肢静脉性溃疡的记载,并指出了其难以愈合的特点,Vlu因其“愈后易溃,溃后难敛”,成为外科长期难以解决的难题,造成了较高的致残率。欧洲下肢静脉曲张性溃疡发病率为0.1%~1%。美国因下肢溃疡而住院的患者占20%。我国因下肢慢性难愈性创面在外科进行住院治疗的患者占外科住院患者的1.5%~3%。可以预见的是随着我国社会老龄化的加重,我们将面临每年数以万计增长的下肢慢性难愈性溃疡患者。 现代医学已经发现由于病理性微生物负荷造成皮肤溃疡表面微生态环境的生理性平衡被打破是溃疡难以愈合的重要因素,下肢慢性溃疡经久不愈形成了难愈性创面,其创面已寄居着庞大复杂的微生物群,形成了一个包含已知与未知病原微生物及有益微生物群(EM)的微生态环境,目前国内对创面的微生物研究对象尚局限在实验室可培养的已知菌种,研究手段相对局限,抗生素的治疗仅针对个别已知菌种。近年来逐步受到医学界重视并急速发展的宏基因组学在这一点上具有明显的优势,是解决这一问题的有效手段。宏基因组学抛弃了传统的培养方法,不使用已知的传统微生物的基因组,他的研究对象是某一特定环境中所有的细菌和真菌基因组DNA,能够测得的基因覆盖了一切可培养和尚未能培养的微生物,通过克隆的方式以及异源表达来筛选目的基因及其产物,本课题选择宏基因组学研究下肢慢性难愈性创面目的是希望能收集更广泛的创面微生物信息,从而更全面的认识创面的微生态环境结构[2]。 中医药的外治干预手段可以利用“祛腐生肌,活血化瘀”的外用药物,通过改善局部炎症微环境、纠正循环障碍以及调节菌群失衡来达到加速创面愈合的目的,但其对于创面微环境的作用机制分析尚缺少全面的实验室数据支持,本课题利用宏基因技术手段全面评价中医药外用对于慢性下肢静脉性溃疡的微生态作用,进一步阐述“祛瘀利于生肌”的学术观点,对阐明中医外用药物“祛腐生肌、化瘀生肌、补虚生肌”的理论有重要意义,为后续筛选奠定基础,提供更全面的基因资源。研究工作主要分为以下几部分: 第一部分研究背景 1.慢性下肢静脉性溃疡的流行病学特点 1.1微生态环境与创面愈合 1.2中药治则治法与创面微生态研究 2.宏基因组和宏基因组学技术 2.1宏基因组学的概念 2.2宏基因组学的技术 2.3宏基因在相关医学领域的发展及应用 2.4皮肤微生物宏基因组学研究进展 创面微生物宏基因组学研究进展 2.5导师对慢性皮肤溃疡的认识与前期研究基础 2.6本研究的主要内容与目的 第二部分祛腐生肌法对下肢溃疡的临床疗效观察 目的:观察中药长皮膏治疗慢性下肢静脉性溃疡(VLU)的临床疗效 方法:选取VLU患者49人,随机分为两组,治疗组25例使用长皮膏治疗,对照组24例使用西药洗必泰油纱治疗,通过T检验比较两组创面愈合率及一般情况评分及中医证候积分评价。 结果:两组患者在7天、14天创面治愈率均值比较T检验P>0.05,无显著性差异,在21天、28天治愈率T检验P<0.05,有显著性差异。治疗后,两组在创面面积及深度方面,均值T检验结果P<0.05,有显著性差异,创缘潜行程度两组评分的均值比较P>0.05,无显著性差异;在疼痛程度及频率方面,均值T检验结果显示P<0.05,有显著性差异;脓液量方面评分均值比较P<0.05,有显著性差异;在创面渗出物性状、色泽、气味、脓液量四方面评分,均值T检验结果P<0.05,有显著性差异;两组在肉芽量、周围皮肤活力、上皮量三方面评分,均值T检验结果P<0.05,有显著性差异。 结论:中药长皮膏临床疗效明显优于洗必泰油纱对照组。 第三部分下肢皮肤微生态环境参数与特点 目的:观察慢性下肢静脉性溃疡与创周正常皮肤微生物OTU多样性 方法:本研究利用宏基因组学的方法,采用高通量测序,对慢性下肢溃疡患者下肢正常区域皮肤微生物群落多样性及功能代谢进行收集及分析,并通过统计学关联分析法,推测不同性别、部位的创面微生物宏基因组的区别。 结果:进入研究的对象共36例,经电泳抽提质检后去除3例条带色淡的数据,最终33例进入宏基因组测序。提取研究对象的创面及创周微生物宏基因组DNA,进入高通量测序程序,总共得到的reads数量为156,863个。稀释分析发现,16例慢性下肢静脉性溃疡患者shannon,chaol,observed species,goods_coverage,simpson5个alpha多样性指数稀释性曲线均趋向缓和,说明样本量达到较为合理的饱和。 第四部分下肢慢性溃疡创面与正常皮肤微生态环境的对比研究 目的:观察慢性下肢静脉性溃疡与创周正常皮肤微生物种群多样性及分布差异 方法:利用宏基因组学的方法,采用高通量测序,对慢性下肢溃疡患者创面微生物群落多样性进行收集及分析,在进行分类学分析时,为了获得每个OTU的分类信息,我们先比对每一条典型序列与Greengenes2013-08 release数据库内所包含的序列,再找出数据库内序列最相近且可信度达80%以上的种属信息。根据注释的相应物种,在门分类水平上统计每个样品的序列数目。 结果:下肢慢性静脉性溃疡分泌物菌种多样性明显较正常个体单一化,正常皮肤菌群分布较为平均,优势菌种依次为纤维杆菌门(Fibrobacteres),变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)。溃疡组菌群集中在变形菌门(Proteobacteria),其次为纤维杆菌门(Fibrobacteres),其余少部分为放线菌门(Actinobacteria),而其他菌种在样本丰度柱状图中仅占极少部分。部分菌种仅在正常皮肤组存在,而在溃疡组成分为0,如装甲菌门(Armatimonadetes)、绿弯菌门(Chloroflexi)、纤维杆菌门(Fibrobacteres)、梭杆菌门(Fusobaeteria)、固氮菌(gn02)、OP11(待划分菌种)、浮霉菌门(Planctomycetes)、互养菌门(Synergistetes)以及疣微菌门(Verrucomicrobia)。数据秩和检验统计结果显示,在门级别两组有显著性差异的菌种有10个。 第五部分中药长皮膏干预慢性下肢溃疡创面微生态调控作用分析 目的:观察中药长皮膏对慢性下肢溃疡微生态的调控作用。 方法:在进行分类学分析时,为了获得每个OTU的分类信息,我们先比对每一条典型序列与Greengenes2013-08 release数据库内所包含的序列,再找出数据库内序列最相近且可信度达80%以上的种属信息。根据物种注释,统计每个样品在门、纲、目分类水平上的序列数目。 结果:柱状图数据提示:治疗前溃疡面菌群较正常皮肤菌群种类单一,以变形菌门为主,治疗后厚壁菌门及放线菌门内的菌种明显增多,门分类下的菌群多样性结构与正常组相近。从纲层面分析可见,治疗前溃疡面占绝对优势的菌种为γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)。生物界中的很多重要的病原菌属于γ-变形菌纲,它属于变形菌门下的纲层面分类,同一纲层面分类下的菌种好包括沙门氏菌(Salmonella),多见于肠炎与伤寒;耶尔辛氏菌属(Yersinia),可见于鼠疫以及霍乱。值得一提的是,在皮肤溃疡领域常见而且非常重要的模式生物大肠杆菌也属于γ-变形菌纲。而治疗后Bacilli(芽孢杆菌纲)比例增加,与正常组相近,Bacilli是厚壁菌门的一纲,包含有芽孢杆菌目和乳杆菌目两目,其下包含有芽孢杆菌属和其他如李斯特菌属等革兰氏阳性菌。 由目层面菌种变化可以发现,治疗前后虽然菌群基因分布仍以变形菌门为主,但其目层面分类已有变化,治疗前变形菌(门)γ-变形菌(纲)的组成以pseudomonadales(假单胞菌目)占绝对优势(99%),但治疗后在同一纲分类下出现了Pasteurellales(巴斯德氏菌目)、Rhizobiales(根瘤菌目)、鞘脂单胞菌目(Sphingomonadales)、以及肠杆菌目(Enterobacteriales),其结构与正常皮肤变形菌结构组成相近。而Lactobacillales(乳杆菌目)、Clostridiales(梭菌目)等菌种比例均提高,与正常组接近。 结论:中药长皮膏治疗慢性下肢静脉性溃疡疗效显著,其机理并不是完全杀灭创面优势菌种,但其通过增加创面除优势菌种外其他菌种的多样性及成分含量比例,通过竞争性生长,弱化致病菌的致病作用,加速创面的愈合。