目的:免疫治疗是近年来最具前景的肿瘤治疗方法。在肿瘤免疫治疗中,细胞免疫起着至关重要的作用。抗肿瘤效应T细胞包括CD4⁺辅助性T细胞和CD8⁺细胞毒性T细胞。Th9细胞是新近发现的一种Th细胞亚型,其主要特征是可分泌大量的IL-9。我们和其他研究团队最近发现Th9/IL-9在小鼠体内具有很强的抗肿瘤活性,其对肿瘤的抑制效应要优于其他Th细胞。这表明,在肿瘤免疫治疗中如何更有效的诱导和扩增肿瘤特异性Th9细胞对提高肿瘤免疫疗效具有重要意义。OX40/OX40L曾被认为是唯一能促进Th9细胞生成的TNF/TNF受体家族成员。然而,最近的研究表明TNF/TNF受体家族成员TL1A和GITR也能强有力的促进Th9细胞的生成。这提示,TNF/TNF受体家族其他成员,如代表TNF家族原型的TNF-α,也可能有助于Th9细胞生成并促进Th9/IL-9发挥抗肿瘤效应。因此,本课题的研究目的是探讨TNF-α在促进Th9细胞生成中的作用,并阐明其作用机制,为肿瘤免疫治疗提供新策略。方法:为了研究TNF-α在Th9细胞生成中的作用,通过流式细胞分选仪分选得到初始CD4⁺T细胞(CD4⁺CD25^-CD62L^hi),在Th9细胞极化条件下（抗CD3/CD28抗体和TGFβ/IL-4）,加入或不加入TNF-α,体外诱导Th9细胞生成。然后以q PCR、ELISA和/或流式细胞仪检测Th9细胞表达的IL-9 m RNA和蛋白水平,并检测Th9细胞的存活情况及细胞活性。TNF-α受体包括TNFR1和TNFR2,首先通过流式细胞仪检测初始CD4⁺T细胞的TNFR1和TNFR2的表达情况。然后在Th9细胞极化条件下,加入TNFR1或TNFR2的封闭抗体,检测封闭TNFR1或TNFR2能否影响TNF-α对Th9细胞生成的促进作用。TNF/TNF受体家族成员OX40/OX40L、TL1A和GITR促进Th9细胞生成依赖于NF-κB或STAT5信号通路,为了研究TNF-α诱导Th9细胞生成过程中是否活化了NF-κB或STAT信号,在Th9细胞极化条件下,通过Western Blot检测STAT分子的磷酸化水平。加入STAT5抑制剂或NF-κB抑制剂,检测TNF-α能否促进Th9细胞的生成。然后通过荧光素酶报告系统进一步验证NF-κB分子是否能结合并活化Il9启动子。结果:TNF-α显著促进了Th9细胞的生成,促进了Th9细胞存活,并增强了Th9细胞的细胞活性。TNF-α诱导的Th9细胞除了Il5和Il13有少量增加外,不表达已知的Th9细胞相关转录因子Pu.1和Irf4,以及其他Th细胞的特异性转录因子和细胞因子。初始CD4⁺T细胞表达TNFR1和TNFR2,封闭TNFR2显著抑制了TNF-α对Th9细胞生成的促进作用,封闭TNFR1则不会抑制TNF-α对Th9细胞生成的促进作用。TNF-α能活化STAT5,抑制STAT5减弱了TNF-α促进Th9细胞生成的作用。而抑制NF-κB也能抑制TNF-α促进Th9细胞生成的作用,且NF-κB分子能结合并活化Il9启动子,从而促进IL-9的表达。结论:TNF-α通过TNFR2/STAT5和TNFR2/NF-κB信号通路来促进Th9细胞的生成。