小分子荧光探针因具备结构可调控、特异性好可用于可视化检测等特点,引起众多研究者的兴趣。但目前开发的荧光探针仍然存在一些不足。第一,对结构相似度大的分析物的检测容易受到干扰。第二,生物体系的自吸收使短波长发射的荧光探针不适合在组织和活体中进行深层成像,这限制了其在生物系统中的进一步应用。第三,对亚细胞微环境中生物活性分子的实时、原位、动态、准确监测,仍然存在着定位效率低、响应速度慢,抗干扰能力不理想等缺点。因此,为实现生物样品中活性物质的特异性检测,以及亚细胞水平中活性分子的成像研究,本文分别以常见生物活性物质半胱氨酸（Cys）、次氯酸（HCl O）作为研究对象,设计合成了三种不同类型的小分子荧光探针,开发Cys及HCl O的检测方法,研究探针对活性分子响应机制。具体内容如下:（1）基于Cys与丙烯酸酯基之间加成-环化反应,开发了一种绿光发射的Cys荧光探针（E）-2-（2-（苯并[d]噻唑-2-基）-2-氰乙烯基）-5-（二乙氨基）苯基丙烯酸酯（BTIC-Cys）。BTIC-Cys分子结构中的丙烯酸酯基,具有强拉电子能力,阻碍了分子内电荷转移（ICT）过程,荧光猝灭,加入Cys后,丙烯酸酯基离去,释放羟基,羟基进一步与氰基反应成环,荧光恢复,实现对Cys的检测。探针对Cys检测的线性范围为0-90μM,检测限（LOD）为208 n M（S/N=3）。此外,在高半胱氨酸,谷胱甘肽和其它生物硫醇存在下,BTIC-Cys实现了对人血清中Cys的特异性检测,并取得了良好的回收率。（2）基于次氯酸（HCl O）与二甲氨基硫代甲酯（DMTC）发生氧化裂解反应,设计合成了一种红光发射的荧光探针O-（4-（2,2-二乙腈）-2,3-二氢-1-氢-蒽-6-基）二甲基氨基硫代甲酯（HM-OCl）来检测HCl O。HM-OCl分子结构中的DMTC和丙二腈基是吸电子基团,阻碍了ICT效应,荧光猝灭,加入HCl O溶液后,HM-OCl的DMTC部分发生氧化裂解反应,释放羟基,ICT效应恢复,荧光增强,实现了近红外荧光检测HCl O。该探针对HCl O检测的线性范围为0-70μM,LOD为445 n M（S/N=3）。此外,HM-OCl成功应用于宫颈癌细胞（He La）外源性HCl O的荧光成像分析。（3）基于苯基磺酰胺开发了一种靶向高尔基体检测HCl O荧光探针。当加入HCl O溶液时,探针O-（1,3-二氧代-2-（4-氨磺酰基苯基）-2,3-二氢-1H-苯并[去]异喹啉-6-基）二甲氨基甲酸酯（Gol-OCl）的DMTC部分发生氧化裂解反应,释放羟基,ICT效应恢复,荧光增强,在5 s内,实现对高尔基体中次氯酸的原位实时检测。Gol-OCl对HCl O检的线性范围为0-70μM,LOD为212 n M（S/N=3）。Gol-OCl具有灵敏度高、选择性好、细胞毒性小以及良好的靶向高尔基体的共定位效果,该探针已成功应用于巨噬细胞高尔基体内HCl O的荧光成像分析。