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鸡传染性支气管炎（Infectious bronchitis,IB）是由传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus,IBV）引起的一种高度接触性传染病,给家禽饲养带来了严重的经济损失,IBV全球广泛分布并且存在很多种血清型。IBV新血清型的不断出现迫切需要一种安全高效的疫苗用毒株制备方法以应对这些变异株。利用反向遗传操作来改造IBV基因组可以满足这一要求,构建的重组病毒有望成为新的疫苗用毒株。本研究首先构建了可在vero细胞生长的IBV Beaudette（p65）毒株的感染性克隆,简略方法如下:利用RT-PCR的方法从感染病毒的细胞总RNA中扩增出IBV基因组拆分的5个片段,然后分别插入到pGEM-T Easy或者pCR-XL-TOPO载体中,在此过程中BsaI或BsmBI酶切位点通过引物带入各个片段的两端,19个核苷酸的T7启动子加到A片段的5’端用于依靠T7聚合酶进行体外转录。5个重组质粒用BsaI或BsmBI酶切割后得到相应的5片段,然后将纯化的5片段连接成IBV基因组全长cDNA,全长cDNA和含IBV N基因的线性质粒被分别体外转录,转录后的两产物混合后电转染Vero细胞,具有感染性的病毒被拯救成功。为探索以IBV Beaudette毒株为骨架表达H120 S基因膜外区的可行性,本研究将H120 S基因膜外区段（1,302bp）置换到Beaudette株全长cDNA相应区段,构建了重组全长cDNA,然后以其为模板体外转录出全长转录本,该转录产物和N基因转录本一起电转染Vero细胞,48小时收获细胞继续传代,直至第4代时出现合胞体,拯救获得重组IBV,并命名为rBeau-H120（S1）。RT-PCR证明rBeau-H120（S1）基因组中包含有完整的H120 S基因膜外区段。Western-blot实验证实rBeau-H120（S1）的N蛋白有表达,表明重组病毒拯救成功。rBeau-H120（S1）连续传代后测定TCID50和EID50,结果显示,该重组病毒在Vero细胞中的滴度可达到105.90±0.22TCID50/mL,在9日龄SPF鸡胚中生长滴度峰值为106.13±0.23EID50/mL。免疫保护实验表明,在接种重组病毒21天时,鸡群抗体阳性率达到90%,使用M41强毒株(103EID50/只)攻毒时免疫保护率为85%。同时,我们将4/91毒株S基因膜外区段置换到Beaudette株全长cDNA相应区段,构建了重组病毒BeauR-4/91（S1）。BeauR-4/91（S1）在vero细胞内的滴度与亲本毒Beaudette株基本一致,峰值为105.75 TCID50/mL,接种鸡只后无致病力,在体内仅可有限复制。免疫保护实验表明,BeauR-4/91（S1）接种7日龄雏鸡后21天用野生型4/91毒株(103EID50/只)攻毒时免疫保护率为80%。本研究构建的重组IBV有望成为现有疫苗的替代株,同时为将来田间毒株S基因膜外区段置换到Beaudette株全长cDNA相应区段提供参考。CD59蛋白可在补体活化的最后阶段阻止攻膜复合物的形成,有研究表明,HIV病毒颗粒可携带CD59分子而提高其在体液循环中的病毒滴度,为了提升重组IBV在体内的滴度而增强免疫效果,我们研究了补体调节蛋白CD59对IBV生命过程的影响,研究结果显示,IBV粒子可携带CD59,废除CD59功能后可增加IBV颗粒对抗体依赖的补体介导的裂解作用的敏感性,显著降低IBV的感染性。此外,IBV感染细胞后可使细胞膜上CD59的表达量减少,过表达CD59可增强细胞上清液中病毒的滴度,而敲降或者切除CD59时得到相反的结果,这些数据表明CD59可能参与IBV释放,同时为改造IBV弱毒疫苗株提供了新的分子靶标。