麦胚作为面粉加工的主要副产品,其蛋白质含量大约为30%,是一种潜在的植物蛋白资源。目前,小麦麦胚大多被用作动物饲料或直接被废弃,造成资源的严重浪费。本文以小麦麦胚为原料,采用亚临界水法萃取麦胚蛋白,进而对蛋白进行结构与功能性研究,并与碱溶酸沉法比较。在此基础上,采用生物活性追踪法从麦胚酶解物分离制备抗氧化肽,并对肽的组成进行初步分析;最后利用Caco-2细胞模型对抗氧化肽的吸收转运进行研究。以期为小麦麦胚的综合利用和开发提供理论依据。本论文主要研究内容和结果如下:1.麦胚蛋白的亚临界水萃取及其结构与功能性质的研究(1)通过单因素和响应面分析实验对亚临界水法萃取麦胚蛋白的工艺进行优化,得出最佳萃取工艺参数为:萃取温度130℃,萃取时间15 min,料水比1:20(g/mL),pH为9.40。在此条件下,麦胚蛋白的萃取率达42.25%,与传统碱溶酸沉法相比,萃取率提高14.12个百分点。(2)采用亚临界水法和碱溶酸沉法萃取得到的麦胚蛋白在二级结构上存在一定差异,但功能性质基本相当。与碱溶酸沉法得到的蛋白相比,亚临界水法得到的蛋白α-螺旋含量减少、β-折叠和蛋白无规则卷曲的含量显著增加,分子结构由有序向无序转换,同时蛋白表面疏水性增强;经形态学观察发现亚临界水法得到的蛋白表面有空洞、部分聚集;氨基酸分析表明,亚临界水法萃取得到的蛋白疏水性氨基酸含量(29.02%)高于碱溶酸沉法(含量为25.53%)。2.麦胚蛋白酶解制备抗氧化肽的研究(1)采用碱性蛋白酶酶解麦胚蛋白,测得其水解度和肽得率分别为16.35%和63.31%;酶解液对DPPH·自由基的清除呈浓度剂量效应,其IC50的值为4.16 mg/mL;采用不同分子量的超滤膜对酶解液超滤分离,得到4种分级肽,其所占比分别为:UF-1(<1 KDa)47.45%、UF-2(1-3 KDa)10.54%、UF-3(3-5 KDa)11.86%、UF-4(>5 KDa)30.15%,其中3 KDa的肽占比达57.99%。通过对超滤组分进行抗氧化能力的测定,得出相对分子量<1 KDa的抗氧化活性最强。(2)利用Sephadex G-15凝胶色谱分离纯化UF-1(MD<1 KDa),得到7个组分,通过检测各组分的DPPH自由基清除能力,筛选出抗氧化活性较强的两个组分G-15-4和G-15-3,其IC50分别为1.17 mg/mL和1.23 mg/mL。通过对其分子量分布测得G-15-4和G-15-3的相对分子质量分别为181-370 Da和370-515 Da,通过氨基酸组分分析,得出G-15-4主要氨基酸组成为Phe、Tyr、Glu、His和Pro,G-15-3主要氨基酸组成为His、Glu、Phe、Tyr和Leu。3.抗氧化肽G-15-4的吸收与转运(1)当细胞培养到21 d时,其单细胞层的跨膜电阻TEER>1000?·cm2,在转运介质中TEER>800Ω·cm2;Caco-2细胞模型两侧碱性磷酸酶(ALP)的活性比达到3:1左右;荧光黄的表观通透系数Papp小于1.0×10-6 cm/s。表明已经建立了完整性良好的Caco-2细胞单层膜,可以作为研究体外吸收转运的模型。(2)通过MTT法检测G-15-4在0.125-2.0 mg/mL浓度范围内孵育Caco-2细胞24 h,不产生细胞毒作用,故选择0.25、0.50、0.75 mg/mL三个浓度G-15-4作为转运试验。(3)G-15-4各组分在Caco-2细胞模型上的吸收分别具有时间和浓度依赖性,其BL和AP两侧的Papp比值Pratio基本在0.5-1之间,表明其跨膜转运主要为被动运输;G-15-4各组分在Caco-2细胞膜上的跨膜转运与温度有关,P-gp糖蛋白不参与其转运。具体是何种载体参与尚需继续深入研究证实。