仿刺参(Apostichopus Japonicus, Selenka)体腔液中调理素样分子的研究

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仿刺参是我国辽宁、山东、河北等北方沿海省份重要的养殖经济种类。仿刺参体腔液中的吞噬细胞在吞噬过程中起重要作用,而吞噬作用在无脊椎动物免疫防御中居于核心地位。调理素是一些血浆蛋白质,它们可以结合到病原体表面,使其成为靶细胞,为吞噬作用提供标记,从而增强吞噬细胞对病原体的吞噬作用。目前已在少数无脊椎动物中发现了调理素样分子。为了探究仿刺参体腔液中是否存在调理素样分子,且分析其调理素样分子的的性质,采用热致死酵母细胞作为吞噬实验靶细胞。通过SDS-PAGE,凝胶过滤层析,质谱分析,氨基酸序列分析等方法进行蛋白质的纯化和分析;吞噬细胞对酵母细胞的吞噬作用研究采用荧光显微镜观察。结果表明,仿刺参的吞噬细胞在等渗缓冲液、无细胞体腔液和酵母细胞作用的无细胞体腔液中均具有吞噬能力。在不同的反应基质条件下,吞噬细胞对酵母细胞的吞噬率有所不同。当反应基质为无细胞体腔液时,吞噬细胞对酵母细胞的吞噬率最高。SDS-PAGE分析结果表明,一种分子量约为18 kDa的分子可以结合到热致死酵母细胞上,增强吞噬作用。通过凝胶过滤层析纯化出这种调理素样分子。调理素样分子功能检测实验表明,这种约18 kDa的调理素样分子可增强吞噬细胞的吞噬作用,但其并不能单独提高吞噬作用,还需要和体腔液中某种物质共同作用才可使吞噬作用得以增强。调理素样分子N端前15个氨基酸序列及质谱分析结果表明,此调理素样分子是无脊椎动物调理素样分子中的新成员。Western blots与ELISA分析结果均表明,脂多糖(LPS)免疫刺激和受伤均可使体腔内调理素样分子水平增加。注射LPS的仿刺参体腔液中调理素样分子含量在注射后1 h显著增加(P<0.05)。注射后1 h到2 d内显著高于注射前15 min水平(P<0.05)。最大量出现在注射后3 d到6 d,且显著高于注射后1 h到2 d水平(P<0.05)。6 d后,调理素样分子水平开始下降,并恢复到在注射后1 h到2 d水平(P>0.05)。注无菌海水(SSW)的海参体内调理素样分子水平较低。注射前15 min到注射后12 h体腔液中调理素样分子含量均无显著变化(P>0.05)。注射后第2 d到8 d,调理素样分子含量升高并显著高于注射前15 min到注射后12 h水平(P<0.05)。这是因为采取注射的方式,仿刺参会受伤,而受伤所产生的应激也可刺激机体产生免疫应答。注射LPS的仿刺参体腔液中调理素样分子水平除注射前15 min,注射后第2 d和8 d无显著差异外(P>0.05),其它时间均显著高于注射SSW组(P<0.05)。这表明了LPS免疫刺激及受伤刺激均可使仿刺参体内调理素样分子含量增加。而受伤和LPS共同刺激可使机体分泌更多的调理素样分子。该调理素样分子具凝集素性质,推测它是一种凝集素。该调理素样分子可以凝集兔、鸡、鼠、鲫和人的A、B、O、AB型红细胞。其凝集结果为:鸡>兔>人(A= B = O = AB) >鼠>鲫。凝菌结果表明,纯化的调理素样分子可凝集革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌。细菌中以鳗弧菌对调理素样分子最敏感。在25-60℃保温30 min ,凝集活性均未见改变。在70℃30 min热处理后仍然对鸡红细胞显示出凝集活性,活性开始下降。在80℃热处理30 min后失去凝集活力。当5.0≤pH≤9.0时,仿刺参调理素样分子具有活性,当pH为6.0-8.0时,活性最高,当pH为5.0或9.0时,活性下降,当pH≥10.0或≤4.0时,失去凝集活力。调理素样分子不被所测试的D-葡萄糖(D-Glueose)、D-半乳糖(D-Galaetose)、L-Arabinose (L-岩藻糖)、D-木糖(D-Xylose)、D-甘露糖(D-Mannose)、L-鼠李糖(L-Rhamnose)、D-果糖(D-Frutose)和LPS所抑制。可被N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、N-乙酰神经氨酸(NeuAc)、牛下颚粘液素(Bovine submaxillary mucin, BSM)、胎球蛋白(Fetuin)、脱唾液酸牛下颚粘液素(Asialo-BSM)、脱唾液酸胎球蛋白(Asialo- Fetuin)所抑制。N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)和N-乙酰神经氨酸(NeuAc)的最小抑制浓度分别为20.15 mmol/L、12.50 mmol/L和0.25 mmol/L。牛下颚粘液素(Bovine submaxillary mucin, BSM)、胎球蛋白(Fetuin)、脱唾液酸牛下颚粘液素(Asialo-BSM)、脱唾液酸胎球蛋白(Asialo-Fetuin)的最小抑制浓度分别为0.39 mg/mL、1.56 mg/mL、3.12 mg/mL和6.26 mg/mL。EDTA,Mn2+、Ca2+、Mg2+、K+等金属离子作用的调理素样分子对鸡红细胞的凝集活性保持不变,即它们的存在不影响该调理素样分子的凝集活性。
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