【摘 要】
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偏关苜蓿（Medicago sativa cv.Pianguan）是山西省地方优良品种,干旱是限制其生长的主要因素之一。挖掘抗旱相关基因,并将其应用于偏关苜蓿遗传改良,对于优异地方种质的再创制具有重要意义。课题组前期利用高通量测序的方法从偏关苜蓿中筛选出与干旱相关的miR397-5p,并将其成功转入烟草中。本试验使用20%PEG-6000胁迫野生型和过表达miR397-5p烟草,分别在胁迫0,12
【基金项目】
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国家自然科学基金青年基金项目（31402131）； 国家自然科学基金面上项目（32071872）； 晋中市科技重点研发计划项目（Y202012）；
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偏关苜蓿（Medicago sativa cv.Pianguan）是山西省地方优良品种,干旱是限制其生长的主要因素之一。挖掘抗旱相关基因,并将其应用于偏关苜蓿遗传改良,对于优异地方种质的再创制具有重要意义。课题组前期利用高通量测序的方法从偏关苜蓿中筛选出与干旱相关的miR397-5p,并将其成功转入烟草中。本试验使用20%PEG-6000胁迫野生型和过表达miR397-5p烟草,分别在胁迫0,12,24,36,48,60,72 h时对两种烟草的生理特性进行验证,测定胁迫0,24,48,72 h时木质素和脯氨酸代谢路径关键酶基因相对表达量;构建高效的偏关苜蓿再生体系,并获得过表达miR397-5p偏关苜蓿,探究miR397-5p在烟草中抗旱功能的同时,为后续揭示miR397-5p调控偏关苜蓿抗旱效应及机制提供理论依据和方法学基础。1、各干旱时间点过表达miR397-5p烟草的可溶性蛋白含量和可溶性糖含量均高于野生型烟草,体内亏水程度低于野生型烟草,miR397-5p通过增加植物体内渗透调节物质来增强植物在干旱胁迫下的保水能力。同时,各干旱时间点过表达miR397-5p烟草的MDA含量低于野生型烟草,CAT、SOD、POD活性高于野生型烟草,过表达miR397-5p烟草具有较强的保护酶系统来清除体内的活性氧自由基。2、除胁迫72 h时的过表达miR397-5p烟草木质素含量显著低于野生型外（P＜0.05）,其余各干旱时间点过表达miR397-5p烟草中的木质素含量均极显著低于野生型（P＜0.001）。测定各干旱时间点木质素合成路径相关酶基因表达量,发现除PAL、F5H、CCo AOMT和PAO基因外,过表达miR397-5p烟草各基因相对表达量均低于野生型烟草,同时在干旱胁迫48 h时,过表达miR397-5p烟草中PAL、F5H和CCo AOMT的相对表达量显著降低（P＜0.05）,推测miR397-5p可能通过调控木质素合成相关酶基因的表达影响木质素合成。3、干旱胁迫24 h过表达miR397-5p烟草的脯氨酸含量显著高于野生型烟草（P＜0.05）,胁迫36 h过表达miR397-5p烟草的脯氨酸含量极显著高于野生型烟草（P＜0.01）。通过测定脯氨酸代谢关键酶活性可得,各胁迫时间点,过表达miR397-5p烟草的δ-OAT活性和P5CS活性均高于野生型烟草,而Pro DH活性均低于野生型烟草。在干旱胁迫0、24 h时,过表达miR397-5p烟草δ-OAT基因相对表达量极显著高于野生型烟草,干旱胁迫72 h时,过表达miR397-5p烟草P5CS基因相对表达量显著高于野生型烟草（P＜0.05）。推断干旱胁迫前期,miR397-5p参与调控鸟氨酸-脯氨酸途径,随胁迫时间的延长转为调控谷氨酸-脯氨酸途径。4、本试验建立了一套优化的偏关苜蓿再生体系,即偏关苜蓿种子萌发培养条件以0.1%Hg Cl2消毒6 min后接种于1/4MS培养基为最佳;最好的愈伤诱导培养基为MS+2mg·L-12,4-D+0.4 mg·L-1KT;愈伤分化培养基以UM+1.6 mg·L-1KT为最优;下胚轴作为外植体比子叶愈伤诱导率及分化率高。此外,成功构建了过表达载体PEG100-pre-miR397-5p,并通过农杆菌介导的遗传转化法成功导入偏关苜蓿,获得过表达miR397-5p偏关苜蓿阳性植株。
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