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本研究首先对建鲤半胱氨酸蛋白酶抑制剂Stefin进行原核表达及纯化;而后对其抑制活性特征进行初步鉴定;最后利用荧光定量PCR及免疫组化法对Stefin在建鲤不同组织中的mRNA、蛋白表达水平进行了分析。1.建鲤Stefin的原核表达及纯化将含有重组表达载体Stefin-pET30a的表达菌株E.coli BL21（DE3）于诱导剂IPTG终浓度为1 mmol/L,37℃,180 r/min条件下诱导6 h。菌体破碎后,依次经尿素浓度0.5 mol/L、1.0 mol/L、5.0 mol/L的尿素裂解液重悬,洗涤菌体溶解目的蛋白,重组建鲤Stefin最终溶解于5.0 mol/L尿素裂解液中。利用镍柱亲和层析进一步纯化目的蛋白,于135min,咪唑浓度374.625 mmol/L处形成单一峰。收集洗脱蛋白,经SDS-PAGE检测重组建鲤Stefin蛋白的表观分子量约为11 kDa,经TSK-GEL G2000SWXL高效液相色谱检测,在保留时间26.04 min处出现单一蛋白峰,纯度为97.13%。2.抑制活性特征鉴定对重组建鲤Stefin进行抑制活性特征鉴定,结果表明建鲤Stefin对半胱氨酸蛋白酶类的木瓜蛋白酶（Papain）、组织蛋白酶B（Cathepsin B）和组织蛋白酶L（Cathepsin L）具有特异性抑制活性,对丝氨酸蛋白酶类的胰蛋白酶（Trypsin）和胰凝乳蛋白酶（Chymotrypsin）不具有抑制活性;采用荧光合成肽底物法测定不同浓度的重组建鲤Stefin对Papain、Cathepsin B和Cathepsin L的抑制情况,发现三种蛋白酶的活性均随着抑制剂含量的增加而降低,且建鲤Stefin对Cathepsin B的抑制效果明显弱于其对Cathepsin L的抑制效果;采用荧光合成肽底物法,分别测定在0.5 Km,1 Km和2 Km值浓度的荧光底物下,重组建鲤Stefin对Papain的抑制活性,并根据Dixon plot法作图,结果显示重组建鲤Stefin对Papain的抑制常数Ki=7.75×10-11M（0.0775nM）,是一种非竞争性抑制剂;对重组建鲤Stefin的酸碱稳定性及热稳定性进行鉴定,发现其在极端pH和温度条件下仍能保持较高的抑制活性:在pH 3.013.0范围内,重组建鲤Stefin能够保持60%以上的残余抑制活性,在pH 7.0时活性最高;在4℃80℃范围内,重组建鲤Stefin始终保持了70%以上的残余抑制活性,在4℃时活性最高。3.基因及蛋白水平表达分布情况采用荧光定量PCR对建鲤各组织中Stefin的基因表达量进行分析,其相对表达量由高到低依次为肝胰（14.8941±1.8598）、头肾（13.7121±0.7358）、小肠（7.7958±0.0345）、肌肉（5.6371±0.3878）、肾脏（5.3148±1.8827）、心脏（4.3640±1.1050）、脾脏（1.6640±0.1079）、腮（1.0350±0.0284）。其中,建鲤肝胰和头肾中Stefin的基因表达量极显著高于其他6种组织（P<0.01）,脾脏和腮中的表达量极显著低于其他几种组织（P<0.01）,肌肉、肾脏和心脏三种组织中的Stefin基因表达量差异不显著（P>0.05）。利用纯化后的重组建鲤Stefin免疫的小鼠抗血清,并通过间接ELISA法检测,结果显示其效价达到1:128000以上,表明该抗血清能够用于建鲤组织中Stefin的表达分布情况检测。而后根据建鲤免疫组化染色图,利用IPP6.0软件分析Stefin在建鲤各组织中的光密度及染色面积,得到其相对表达量由高到低依次为肝胰（0.4279±0.0845）、腮（0.2364±0.0837）、心脏（0.1662±0.0602）、头肾（0.1331±0.0516）、肾脏（0.1263±0.0431）、小肠（0.1102±0.0446）、脾脏（0.1058±0.0193）、肌肉（0.1017±0.0329）。其中,建鲤肝胰中Stefin的蛋白表达量极显著高于其他7种组织（P<0.01）,腮中的表达量次之且极显著高于其他5种组织（P<0.01）、显著高于心脏（0.010.05）。