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乙醇在人体内的代谢主要靠体内的两种酶,一种是乙醇脱氢酶(ALcohoL Dehydrogenase, ADH),另一种是乙醛脱氢酶(ALdehydeDehydrogenase, ALDH)。前者使乙醇转化为乙醛,后者使乙醛进一步转化为乙酸,最终分解为二氧化碳和水。人体中,一般都存在前一种酶,而且数量基本是相等的。但缺少后一种酶的人就比较多,ALDH的缺少,使乙醇不能被完全分解为水和二氧化碳,而是以乙醛的形式继续留在体内。有资料表明,乙醛在人体内的过渡堆积是醉酒的主要原因。目前,已知酿酒酵母菌是高产ADH的菌株,而ALDH主要是从动物的肝脏、胰腺或肝细胞线粒体中分离提取,资源有限且价格昂贵。
本文以土壤中的微生物为主要原料,筛选产乙醛脱氢酶(ALDH)的菌株。首先配制10%的土壤溶液,进行梯度稀释;涂布接种于不同培养基,添加不同诱导剂进行培养;挑取单一菌落进行多次纯化培养;得到产酶纯化菌种后,接种到液体培养基中发酵培养。发酵48h~120h,加入不同的保护剂进行细胞破碎,收集粗提液;选用甲烯蓝作为指示剂进行ALDH的定性检测,以确定是否产ALDH,并测定酶的活性。
通过大量实验,目前已从土壤中筛选得到了8株产乙醛脱氢酶的菌株,将其中产酶活力较高的1#菌株送至中国典型培养物保藏中心(CCTCC)鉴定。经鉴定,该菌株为涅氏短状杆菌(Brachybacteriumnesterenkovi),国内尚无报导。B.nesterenkovi菌株其形状为短杆状,大小为0.5~0.75μm×1.0~2.5μm,不产内生孢子,无运动性。通过生理生化特性鉴定可知:B.nesterenkovi菌株可以利用α-酮基-戊二酸、D-半乳糖、乙酸、龙胆二糖、L-乳酸、丙酮酸、α-D-葡萄糖,D-木糖等多种物质作为碳源,利用L-丙氨酸、L-谷氨酸、L-天冬酰胺和丁二胺作为氮源。此外B.nesterenkovi可以产过氧化氢酶、酯化酶、乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶等多种酶。
本文对产乙醛脱氢酶菌株的培养条件、细胞破碎工艺等方面进行了研究。结果表明,当加入0.67%的95%乙醇于牛肉膏培养基,于37℃下培养16h~36h,菌体生长丰满;而发酵培养48h~120h,菌株的产酶能力较强。当离心条件为4000r/min、8min~10min,破碎条件为550w、10min,破碎保护剂用15%(NH4)2S04且与发酵液体积比为1:2时,得到的粗提液中ALDH活性较高,可达12.5U/mL。