本研究通过10个系列试验,在绵羊卵母细胞体外培养液中添加血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF),研究VEGF对绵羊卵母细胞体外受精及胚胎发育的影响,并通过绵羊卵母细胞成熟过程中细胞的形态学结构、细胞骨架、胞内丝裂原活化蛋白激酶(P44/p42 Mitogen-activated Protein Kinases,P44/p42 MAP kinases)、蛋白激酶C (Protein Kinase C,PKC)和酪氨酸蛋白激酶(Protein Tyrosine Kinases,PTK)活性的变化,以及VEGF及其两受体KDR/Flk-1和Flt-1在绵羊卵母细胞成熟过程中表达的研究,揭示VEGF对绵羊卵母细胞体外成熟的作用和机理。一、血管内皮生长因子对绵羊卵母细胞体外成熟、体外受精及胚胎发育的影响试验1:不同浓度VEGF对绵羊胚胎体外发育的影响在绵羊卵母细胞体外成熟培养液(TCM199+胎牛血清)、HSOF受精液及SOF胚胎发育液中添加不同剂量的VEGF(对照组0 ng/ml、试验组Ⅰ5 ng/ml和试验组Ⅱ10 ng/ml),研究其对卵母细胞成熟和早期胚胎发育的影响。结果显示:对照组、试验组Ⅰ、试验组Ⅱ卵母细胞成熟率分别是80.68%、86.09%和85.22%。试验组Ⅰ和试验组Ⅱ与对照组相比,极显著的提高了卵母细胞成熟率(P<0.01),但试验组Ⅰ和试验组Ⅱ之间差异不显著。试验组Ⅰ和试验组Ⅱ的卵裂率分别是75.18%和73.48%,高于对照组的69.38%,但差异不显著。试验组Ⅰ的桑葚胚率和囊胚率是45.45%和30.06%,极显著的高于对照组37.61%和23.65%(P<0.01);同时试验组Ⅱ的桑葚胚率和囊胚率是40.25%和27.80%,低于试验组Ⅰ,高于对照组,但差异不显著。结果表明:体外培养液中添加5ng/mlVEGF为适宜添加量,VEGF明显提高了受精卵发育到桑葚胚和囊胚的能力。试验2:BSA成熟培养液中添加VEGF对绵羊卵母细胞体外成熟、体外受精及胚胎发育的影响本试验采用在成分相对明确的BSA成熟培养液系统中,添加不同浓度VEGF,检测对卵母细胞成熟和胚胎发育的作用。成熟培养液(TCM199+BSA)中分别添加0 ng/mlVEGF对照组、5 ng/ml、10 ng/ml的VEGF试验组卵母细胞成熟培养后,经体外受精和体外培养。结果显示:试验组Ⅰ和试验组Ⅱ的成熟率分别是83.98%和80.23%,对照组是75.76%。试验组Ⅰ和试验组Ⅱ与对照组相比,极显著的提高了绵羊卵母细胞的成熟率(P<0.01),并且试验组Ⅰ和试验组Ⅱ之间差异显著(P<0.05)。试验组Ⅰ的卵裂率是79.39%,高于试验组Ⅱ和对照组的72.24%和75.85%,差异不显著。试验组Ⅰ桑葚胚率是45.03%,明显高于试验组Ⅱ和对照组38.85%和38.94%的桑葚胚率,差异不显著。试验组Ⅰ囊胚率是23.54%,极显著高于对照组的18.09%(P<0.01);试验组Ⅱ囊胚率是21.05%,高于对照组Ⅰ的18.09%,差异不显著。结果表明:BSA成熟培养液中添加5ng/ml VEGF为适宜添加量,对绵羊卵母细胞体外胚胎的发育有积极的促进作用。试验3:VEGF添加对绵羊卵母细胞体外受精多精入卵的影响在绵羊卵母细胞体外成熟培养液(TCM199+BSA)中添加不同剂量的VEGF(对照组0 ng/ml和试验组5 ng/ml)成熟培养,经体外受精培养后,地衣红染色结果显示:试验组和对照组的受精率分别是83.86%和75.75%,多精入卵率分别是7.68%和12.64%,未受精率是8.47%和11.60%。试验组受精率极显著高于对照组(P<0.01);试验组多精入卵率极显著低于对照组(P<0.01);试验组的未受精率显著低于对照组(P<0.05)。结果表明:VEGF明显降低了多精入卵率,有效的抑制了绵羊卵母细胞受精过程中的多精入卵现象的发生。二、VEGF促进绵羊卵母细胞体外成熟的机理研究1、VEGF对绵羊卵母细胞体外成熟过程中细胞核成熟和细胞质成熟的影响试验4:在绵羊卵母细胞体外成熟培养液(TCM199+BSA)中添加不同剂量的VEGF(对照组0 ng/ml和试验组5 ng/ml)进行成熟培养,再采用地衣红染色技术,研究VEGF对绵羊卵母细胞体外成熟过程中染色体形态的影响。结果显示:试验组拥有正常染色体成熟卵母细胞的成熟率是87.42%,高于对照组的83.89%。结果表明:VEGF对卵母细胞体外成熟和维持染色体正常形态具有一定的促进作用。试验5:在BSA成熟培养系统中成熟培养后,采用免疫细胞化学和激光共聚焦显微技术,研究VEGF对绵羊卵母细胞体外成熟过程中α-tubulin蛋白和微管组织中心(Microtubule Organizing Centers,MTOCs)时空迁移和重新组装的影响。结果显示:试验组与对照组相比,极大的促进了α-tubulin从微管组织中心向染色体的空间迁移和重新组装。同时试验得出,试验组和对照组的微管蛋白和MII期染色体的正常分布率分别是77.50%和62.60%。试验组与对照组相比,极显著的提高了微管蛋白和MII期染色体的正常分布率(P<0.01)。结果表明:VEGF促进了MTOCs从胞内和皮质区的消失,并加速了α-tubulin重新分配和向染色体的聚集,有效的提高了卵母细胞核成熟质量。试验6:在BSA成熟培养系统中成熟培养后,采用免疫细胞化学和激光共聚焦显微技术,研究VEGF对绵羊卵母细胞体外成熟过程中皮质颗粒(Cortical Granule,CGs)时空迁移和重新组装的影响。结果显示:试验组与对照组相比,极大的促进了CGs从胞质向皮质区的时空迁移。试验组和对照组的皮质颗粒正常迁移分布率分别为79.24%和60.97%。试验组与对照组相比,极显著的提高了皮质颗粒正常迁移分布率(P<0.01)。结果表明:VEGF通过促进绵羊卵母细胞成熟过程中CGs的时空迁移,对绵羊卵母细胞胞质成熟具有积极促进作用。2、VEGF对绵羊卵母细胞体外成熟过程中细胞超微结构变化的影响试验7:在绵羊卵母细胞体外成熟培养液(TCM199+BSA)中添加不同剂量的VEGF(对照组0 ng/ml和试验组5 ng/ml)进行成熟培养,再结合透射电镜技术,研究VEGF对绵羊卵母细胞体外成熟过程中细胞超微结构变化的影响。结果显示:①VEGF有效促进了微绒毛的发育和变化,增加了游离端斜行插入透明带微绒毛的数量,促进了细胞内外物质交流和养分的吸收;②VEGF促进了皮质颗粒在卵母细胞成熟培养过程中向皮质区迁移的时间和空间变化;③发现特征性绵羊卵母细胞线粒体――带帽状线粒体,并且VEGF对线粒体的迁移有一定的促进作用;④VEGF的添加对卵母细胞成熟过程中脂滴数量的增加没有显著的作用,但VEGF减少了小脂滴聚集为大脂滴。3、VEGF对绵羊卵母细胞体外成熟过程中胞内磷酸化P44/p42 MAP kinases、PKC和PTK活性变化的影响试验8:在绵羊卵母细胞体外成熟培养液(TCM199+BSA)中添加不同剂量的VEGF(对照组0 ng/ml和试验组5 ng/ml)进行成熟培养,再结合酶联免疫技术,检测胞内磷酸化P44/p42 MAP kinases、PKC和PTK活性的变化。结果显示:绵羊卵母细胞成熟过程中三种磷酸化激酶活性都呈波动变化,试验组的P44/p42 MAP kinases、PKC和PTK相对含量始终高于对照组相对含量。成熟培养16小时和20小时时,试验组P44/p42 MAP kinases(Erk1和Erk2)含量显著高于对照组(P<0.05);成熟培养16、21小时和24小时时,试验组PTK含量显著升高于对照组(P<0.05)。结果表明:VEGF添加到绵羊卵母细胞成熟培养液中,改变了PTK磷酸化水平,进一步引起信号传递分子MAP kinase和PKC的磷酸化,从而有效促进了绵羊卵母细胞体外成熟。4、VEGF及其受体KDR/Flk-1和Flt-1在绵羊卵母细胞体外成熟过程中的表达试验9:在绵羊卵母细胞体外成熟培养液(TCM199+BSA)中添加不同剂量的VEGF(对照组0 ng/ml和试验组5 ng/ml)进行成熟培养,再结合RT-PCR技术,研究VEGF及其受体KDR/Flk-1和Flt-1mRNA在绵羊卵母细胞体外成熟过程中颗粒细胞和卵母细胞细胞中的表达。结果显示:①卵母细胞培养前VEGF mRNA在卵母细胞中就有表达。在整个成熟过程中对照组中其表达一直持续,但比培养前的表达量有所下降;在试验组中,VEGF mRNA在卵母细胞中的表达呈下降趋势,到成熟培养24小时时表达量微弱;卵母细胞培养前VEGF mRNA在颗粒细胞中有表达。到培养8小时时,对照组表达量升高,但后期表达量明显下降。试验组在培养8小时时表达量就已经下降,24小时时持续低水平表达。②卵母细胞培养前Flt-1 mRNA在卵母细胞中有微弱表达,随着培养时间的延续表达量明显下降。培养8小时和24小时对照组比试验组表达强,到24小时试验组几乎检测不到Flt-1 mRNA的表达;卵母细胞培养前Flt-1 mRNA在颗粒细胞中有表达,到8小时时对照组表达加强,随培养时间延续其表达量下降,直至24小时检测不到。试验组从培养8小时开始就几乎检测不到Flt-1 mRNA的表达。③卵母细胞培养前KDR/Flk-1 mRNA在卵母细胞中有微弱表达,随着培养时间的延续,无论是试验组还是对照组其表达量都明显上升;卵母细胞培养前KDR/Flk-1 mRNA在颗粒细胞中有强表达,随培养时间的延续其表达量在对照组培养8小时时加强,但在试验组中减弱,培养到24小时时,两组表达量都很微弱。结果表明:外源VEGF的加入,改变了卵母细胞和颗粒细胞中VEGF及其受体KDR/Flk-1和Flt-1 mRNA的表达。试验10:结合免疫细胞化学和激光共聚焦显微技术,研究KDR/Flk-1和Flt-1蛋白在卵母细胞成熟观过程中颗粒细胞和卵母细胞中的表达。结果显示:绵羊卵母细胞成熟培养过程中,无论是在卵母细胞膜表面还是在颗粒细胞膜表面都检测到KDR/Flk-1和Flt-1蛋白的表达。