论文部分内容阅读
第一部分急性高眼压对大鼠视网膜组织AQPs表达影响的实验研究目的:研究眼内压改变对AQP1、3、4、5、9在大鼠视网膜内表达的影响,以探讨AQPs在急性高眼压视网膜损伤中的作用。方法:（1）在体实验成年健康雄性Wistar大鼠384只,随机分为对照组和实验组。实验组采用前房穿刺加压灌注法分别制作75 cm水柱、125 cm水柱和150 cm水柱三组梯度高眼压模型,维持60分钟后停止,取造模成功后3h、12h、24h、48h、72h、5d作为观察点。分别采用免疫组化、免疫荧光双标记激光共聚焦扫描技术、原位杂交、RT-PCR和图像分析技术测定各组相应时间点视网膜内AQP1、3、4、5、9及其mRA的表达变化;同时用干-湿重法检测视网膜组织含水量变化,墨汁灌注实验检测血管通透性改变,光镜和透射电镜下观察视网膜病理改变。（2）离体实验将体外培养的大鼠视网膜Müller细胞随机分为对照组（常压）和0.15 Mpa、0.30 Mpa、0.60 Mpa加压组,各加压组在相应压力作用2h后,恢复常压后继续培养3h、6h、12h、24h、48h后进行相关检测。通过HE染色和透射电镜观察Müller细胞形态变化,采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法、台盼蓝染色法评价细胞活力的变化,并通过免疫（荧光）细胞化学、原位杂交、逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）研究Müller细胞AQP4、9及其mRNA的表达变化。结果:在体实验表明,急性高眼压后视网膜出现水肿样改变:表现为视网膜含水量增多、厚度增加及细胞肿胀,其压力越高,视网膜水肿程度越重;在急性高眼压视网膜水肿形成过程中,视网膜血管渗漏不明显,其渗漏程度与视网膜水肿程度不一致;AQP1、3、4、5、9在正常大鼠视网膜内均有分布;与对照组相比,各实验组AQP4、9的表达明显增加,其表达上调水平与眼压升高程度呈正相关（R=0.8381,p＜0.01）,与视网膜含水量改变以及视网膜内层厚度变化也呈高度正相关（P＜0.01）;其余AQPs（AQP1、3、5）的表达变化不明显。体外实验表明,Müller细胞在不同压力作用后形态有明显改变,表现为细胞体积增大,HE染色胞浆变浅,线粒体肿胀,胞浆内出现一些大小不等的空泡区域;在对照组,AQP4、9主要分布于Müller细胞胞膜,胞浆内有少量表达;与对照组相比,各加压组AQP4的表达水平明显上调,但其分布弥散,在胞膜的分布明显减少,上述改变在加压结束后24h达高峰,其表达变化与对照组相比有显著意义（P＜0.05）,各加压组间比较,其表达差异有显著意义（P＜0.05）;各加压组AQP9的表达水平轻度上调,其表达变化不及AQP4明显。结论:视网膜水肿是急性高眼压早期主要的病理改变,其高峰时间发生在眼压升高后12h-48h,其水肿程度与眼压升高程度呈正相关;在高眼压视网膜水肿形成过程中,视网膜内AQP4、9的表达上调,其表达上调与压力升高程度呈正相关,与视网膜水肿形成明显相关。体外实验表明,超过一定强度的压力（0.15 MPa以上）可导致Müller细胞损伤,其损伤程度与压力高低成正比;同时,Müller细胞AQP4、9的表达上调,其表达变化水平与压力升高程度呈正相关。据上述结果我们推测眼压升高可上调AQP4、9在视网膜等处的表达,引起视网膜水代谢失衡,是高眼压视网膜损伤的重要原因,可能是青光眼视神经细胞损伤的机制之一。第二部分压力因素对大鼠视网膜AQP4与Kir4.1共定位机制影响的实验研究目的:研究压力因素对AQP4与Kir4.1、α-syntrophin、laminin等表达的影响,以探讨AQP4与Kir4.1锚定机制异常的分子机制及其在急性高眼压视网膜损伤中的作用。方法:（1）在体实验采用前房加压灌注制作不同压力大鼠急性高眼压模型,分别采用免疫组化、免疫荧光（双）标记激光共聚焦扫描技术检测各组相应时间点大鼠视网膜内AQP4与Kir4.1及α-syntrophin、laminin的表达水平及其共表达变化,用RT-PCR检测Kir4.1与α-syntrophin的mRNA表达变化;同时,通过暗适应-视网膜电图检测模型鼠视网膜功能改变。（2）离体实验通过制作大鼠视网膜Müller细胞加压模型,观察不同浓度laminin-1对Müller细胞AQP4与Kir4.1表达水平及分布的影响。结果:在体实验表明,急性高眼压早期,ERG上b波波幅出明显降低,其下降幅度与灌注压的高低有关,灌注压越高,其波幅变化越明显;同时,高眼压可引起大鼠视网膜内AQP4与Kir4.1的的极性分布消失,呈弥散状分布于Müller细胞突起上,二者在血管周围的富集消失。AQP4与Kir4.1的这种分布变化与眼压升高程度有关,表现为眼压越高,二者的分布变化越明显;统计分析结果表明,AQP4与Kir4.1的上述改变与视网膜水肿形成以及ERG上b波波幅下降有关（R1=0.8502;R2=0.8734）。本实验还观察到,与膜蛋白结合有关的ECM分子laminin,在实验组大鼠视网膜内的分布明显减少,尤其是在血管周围和内界膜处的分布减少更明显,而与AQP4和Kir4.1锚定有关的细胞内结合分子α-syntrophin的表达变化不明显。体外实验表明,与对照组细胞比较,AQP4与Kir4.1在各加压组Müller细胞膜上的分布减少,二者的共表达水平下降;laminin-1可增加AQP4与Kir4.1在Müller细胞膜上的分布,减少压力所致二者在Müller细胞胞膜上的分布丢失,增加二者的共表达。结论:急性高眼压作用后,AQP4与Kir4.1在视网膜内小血管周围的共表达减少,同时,二者的细胞外结合分子Laminin在上述部位的分布明显减少,而其细胞内结合分子α-syntrophin改变不明显;上述改变与ERG上b波波幅下降以及视网膜水肿形成一致;体外试验表明,压力可引起AQP4与Kir4.1在Müller细胞膜上的共表达减少,而laminin-1可增加AQP4与Kir4.1在Müller细胞膜上的共表达。上述结果表明,AQP4与Kir4.1的共表达减少,可能是急性高眼压早期视网膜水肿形成以及ERG上b波波幅下降的重要原因;Laminin与AQP4和Kir4.1在Müller细胞特殊膜域的锚定有关,其破坏增多或表达下下降,可能是导致AQP4和Kir4.1分布异常的重要原因之一。