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目的:研究缺血再灌注损伤中钙敏感受体(CaSR)参与磷酸化蛋白激酶Cδ(PKCδ)转位线粒体诱发线粒体凋亡通路的机制。
方法:Wistar大鼠(200-250g,雌雄不拘),随机分为五组:正常对照组(Control组),缺血/再灌注组(I/R组),CaSR激动剂组(I/R+盐酸阿米洛利[Amiloride]+维拉帕米[Verapamil]+氯化钆[GdCl3]),CaSR抑制剂组(I/R+Amiloride+Verapamil+GdCl3+NPS2390)和PKCδ抑制剂组(I/R+Amiloride+Verapamil+GdCl3+粗糠柴毒素[Rottlerin])。采用结扎左冠状动脉前降支的方法制作大鼠缺血/再灌注损伤模型,缺血20分钟时按分组给药,30分钟后松开结扎线进行再灌注2小时。同步记录左心室收缩压(LVSP)、左心室舒张压(LVESP)和左心室最大变化速率(±dp/dtmax);HE染色方法检测心肌细胞形态学变化;透射电镜观看心肌细胞超微结构的改变;TUNEL染色检测心肌细胞的凋亡率;急性心肌细胞分离后,激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)观察心肌细胞内游离钙浓度的变化;Western Blot检测心肌细胞线粒体蛋白以及相关凋亡蛋白的表达水平。
结果:LVSP、LVESP、左心室内压及±dp/dtmax随灌注时间的延长而减低;在缺血/再灌注组和CaSR激动剂组中,电镜可见部分凋亡、坏死细胞,细胞核内染色质聚集、边集和凝缩,而对照组和CaSR抑制剂组无上述改变;并且,TUNEL染色检测到在缺血/再灌注组和CaSR组中,细胞凋亡率也明显高于对照组和抑制剂组;激光共聚焦显微镜测定心肌细胞内游离钙浓度和线粒体膜电位,在缺血/再灌注组和CaSR激动剂组,线粒体膜电位降低,细胞内游离钙浓度高于CaSR抑制剂组;Western Blot检测CaSR、Cytc、p-PKCδ/PKCδ、p-ERK/ERK的表达,缺血/再灌注组和CaSR激动剂组显著高于对照组和CaSR抑制剂组。
结论:在成年大鼠心肌缺血再灌注中,钙敏感受体活化PKCδ转位线粒体,引发线粒体凋亡通路,诱导心肌细胞凋亡。