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目的干眼是临床上常见的眼科疾病,其会导致患者的生活质量受到一定程度的影响。由于干眼的发病原因十分复杂,因此干眼的发病机制一直以来都是研究的重点。近些年来针对干眼病因的研究逐渐证明,眼表炎症反应在干眼的发病机制中发挥着至关重要的作用,并且也有大量研究证明micro RNA146a与免疫炎症反应以及炎症中重要通路的调控之间有着极为密切的关系。但由于目前还尚未存在针对micro RNA146a在干眼中表达和作用的研究,因此在本实验中我们通过建立中重度小鼠干眼模型,以及通过干眼相关临床指标检测,病理组织学检查,实时荧光定量PCR,免疫荧光染色来初步探究micro RNA146a在干眼中的表达情况,以及其与干眼眼表炎症反应之间的相关性。方法1.小鼠干眼模型建立和评估选取5周龄BALB/c雄性小鼠40只,小鼠左眼统一为正常对照组(40眼),右眼统一为干眼组(40眼)。用0.2%苯扎氯铵每日滴眼两次,每次5微升滴入小鼠右眼,持续十四天,拟建立中重度小鼠干眼模型。同时小鼠左眼内滴入等体积的磷酸盐缓冲液(PBS)作为正常对照组。滴眼的同时需要定期的检测小鼠的泪膜破裂时间,角膜荧光素钠染色和炎症指数评分,以用来评估小鼠的眼表情况和造模情况。2.组织病理学检查和免疫荧光染色在造模成功后,从40只小鼠中随机的选取20只小鼠来进行进一步的组织病理学检查。通过HE病理染色来观察正常对照组和干眼组小鼠中角膜和结膜的组织结构差异。通过PAS染色来观察结膜中杯状细胞的分布,并对两组中杯状细胞的数量进行计数和比较。此外,通过免疫荧光染色,观察和评估正常对照组和干眼组小鼠的角膜中核转录因子-κB p65(NF-κB p65)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的特异性荧光染色及其荧光强度,从而判断眼表炎症在该小鼠干眼模型中的存在和作用。3.实时荧光定量PCR及micro RNA146a炎症靶点的预测造模成功的剩余20只小鼠,分别提取其正常对照组和干眼组的角膜组织以及结膜组织中的总RNA,紧接着进行反转录,之后采用实时荧光定量PCR分别检测两组中的micro RNA146a、白细胞介素-1受体相关激酶1(IRAK1)、肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)、白细胞介素-1(IL-1)和白细胞介素-6(IL-6)以及白细胞介素-8(IL-8)的相对表达量。通过Pubmed的文献整理和Targetscan软件来预测micro RNA146a在炎症通路中的靶点。结果1.十四天苯扎氯铵造模结束后,干眼组小鼠泪膜破裂时间(BUT)为(3.640±0.493)秒,明显低于正常对照组的(10.645±0.927)秒,且差异具有统计学意义(P<0.05);干眼组角膜荧光素钠染色评分(FLS)为(14.650±0.860)分,其明显高于正常对照组的(1.233±0.927)分,该差异也具有统计学意义(P<0.05)。干眼组的炎症指数为(0.667±0.032),与正常对照组的(0.236±0.068)相比存在明显的升高,此差异具有统计学意义(P<0.05)。2.小鼠角膜和结膜病理组织检查:HE染色结果显示:与正常对照组相比,干眼组中的角膜上皮表面欠平整,细胞数量增多,角膜基质层胶原纤维排列紊乱,并伴有成纤维细胞的活化;与正常对照组相比,干眼组小鼠结膜上皮细胞数量增多,排列欠规整,并伴有明显缺损。小鼠结膜PAS染色结果显示:干眼组结膜组织中杯状细胞数量为(9.500±4.506)个/视野,相较于正常对照组的(29.667±8.756)个/视野明显降低,该差异具有统计学意义(P<0.05)。免疫荧光染色结果显示:正常对照组角膜组织中核因子-κB p65(NF-κB p65)和肿瘤坏死因子(TNF-α)无特异性荧光染色,而干眼组的角膜中出现两种因子的特异性荧光染色,且荧光强度增强。3.实时荧光定量PCR结果显示:与正常对照组相比较,干眼组角膜和结膜组织中的micro RNA146a、白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-8(IL-8)的相对表达量均呈升高趋势,该差异具有统计学意义(P<0.05)。相较于正常对照组的角膜组织,干眼组小鼠的角膜组织中白介素-1受体相关激酶1(IRAK1)的相对表达量降低,而肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)的相对表达量升高;然而,相比于正常对照组的结膜组织,干眼组小鼠的结膜组织中白介素-1受体相关激酶1(IRAK1)的相对表达量升高,而肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)的相对表达量降低,这些差异均具有统计学意义(P<0.05)。4.通过Pubmed的文献整理和Targetscan结果预测得出:近十年来,关于micro RNA146a与IRAK1相关性的研究文章约为53篇,关于micro RNA146a与TRAF6相关性的研究文章约为61篇。经过Targetscan预测可得出人体中micro RNA146a种子区在IRAK 3’UTR和TRAF6 3’UTR上的结合位点,这些位点的weighted context score分别为:0.29和0.15,context score percentile分别为:97和95。同时也可预测出micro RNA146a种子区在小鼠IRAK3’UTR和TRAF6 3’UTR上的结合位点,这些位点的weighted context score分别为:0.31和0.10,context score percentile分别为:96和92。这些结果都反映出IRAK1和TRAF6是micro RNA146a直接靶点的高概率性。结论0.2%苯扎氯铵局部用药可以成功诱导出小鼠干眼模型,对研究炎症反应在干眼中的作用有一定的价值。病理染色中干眼眼表组织结构的变化和免疫荧光染色的结果进一步证明了炎症在干眼中的重要作用。micro RNA146a和炎症因子在干眼中表达水平的升高,以及micro RNA146a对炎症靶点选择性的抑制作用,都可说明micro RNA146a在干眼炎症中具有一定的调节作用,并且其对炎症靶点的调控具有组织特异性。