【摘 要】
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目的:1.克隆人MYOC基因,构建野生型MYOC基因真核表达质粒pEGFP-N3-wMYOC。2.选择一个错意突变Pro370Leu(MYOC基因一个杂合性C1109T突变,使第370个氨基酸由原来的脯氨酸变为亮
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目的:1.克隆人MYOC基因,构建野生型MYOC基因真核表达质粒pEGFP-N3-wMYOC。2.选择一个错意突变Pro370Leu(MYOC基因一个杂合性C1109T突变,使第370个氨基酸由原来的脯氨酸变为亮氨酸),构建Pro370Leu突变型MYOC基因真核表达质粒pDsRed2-N1-mMYOC。3.比较Pro370Leu突变型MYOC(mMYOC)与野生型MYOC(wMYOC)基因在真核细胞中表达的差别,进一步了解原发性开角型青光眼(primary open angle glaucoma,POAG)的发病机制。 方法:1.用RT-PCR法,从人眼组织(角膜缘 睫状体)中扩增MYOC cDNA,克隆入载体pGEM-T,然后酶切,定向克隆到真核表达质粒pEGFP-N3中,构建pEGFP-N3-MYOC重组表达质粒,然后用限制性内切酶消化和DNA测序鉴定。2.以pGEM-T-MYOC质粒中MYOC为模板,用PCR介导的定点突变技术,得到Pro370Leu突变型MYOC基因(mMYOC),并定向亚克隆到真核表达质粒pDsRed2-N1上,得到pDsRed2-N1-m MYOC重组表达质粒,再用限制性内切酶消化和DNA测序鉴定。3.将携带有wMYOC基因的绿色荧光蛋白重组表达载体pEGFP-N3-wMYOC和携带有mMYOC基因的红色荧光蛋白重组表达载体pDsRed2-N1-mMYOC,分别及共同转染真核细胞Hela,用荧光显微镜观察蛋白表达定位情况,并用Western印迹分析蛋白分泌情况和用流式细胞仪观察凋亡。 结果:1.经测序鉴定MYOC cDNA列正确,并经酶切和DNA测序证实pEGFP-N3-wMYOC重组质粒构建正确。2.经酶切和DNA测序,证实
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