目的：　　通过检测miR-300在NSCLC肿瘤组织及细胞系中的表达水平，及其对NSCLC增殖、侵袭、迁移、肿瘤生长能力的影响，以明确miR-300在NSCLC中作为致癌基因或抑癌基因。分析miR-300作用的靶基因HIF3α，以及对miR-300高表达状态的NSCLC侵袭、迁移、肿瘤生长能力的影响，揭示miR-300在NSCLC中发挥作用的可能机制，为NSCLC靶向治疗进一步提供理论依据。　　方法：　　1. 研究对象：组织标本是25例NSCLC患者通过根治性手术切除的肺癌组织和对应的癌旁正常肺组织。细胞系是人NSCLC肿瘤细胞系H1299、H1975和正常人肺细胞系Beas-2B。　　2. microRNA检测和荧光定量PCR检测：采用探针miRNA检测试剂盒(478795_mir, Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA)进行qRT-PCR检测选取的组织标本、细胞系中miR-300的相对表达量及转染后细胞系中miR-300的相对表达量。　　3. 细胞转染：采用慢病毒转染方式将miR-300转染至H1299及H1975细胞系中，获得稳定表达miR-300的细胞系，分为空白对照转染组（miR-NC组）和miR-300转染组（miR-300组），用qRT-PCR检测转染后细胞系中miR-300表达水平，转染成功后进行后续实验。　　4. 质粒构建及转染：使用引物5’-CCC GGG AAG CTT ATG GCG CTG GGG CTG CAG CGC-3’（正向）和5’-CCC GGG GGT ACC TCA GTC AGC CTG GGC TGA GCC-3’ （逆向）从cDNA克隆MGC：99497扩增HIF3α开放阅读框3’（反向），然后使用HindⅢ和KpnⅠ，按照标准分子克隆程序将其克隆到pCMV2载体中。CMV启动子和空载体作为对照，制备空载体质粒和重新引入HIF3α的质粒，然后将其转染到过表达miR-300的H1299和H1975肿瘤细胞系中，分为空载体组（miR-300+vector组）和重新引入HIF3α组（miR-300+HIF3α组），用Western blot检测转染后HIF3α表达水平，质粒构建并转染成功后进行后续实验。　　5. Wound healing划痕检测：将转染后的H1299、H1975肿瘤细胞接种到12孔板上，细胞达100%融合生长后，弃掉培养基，垂直于孔板正上方，用200μl微量移液管头制造细胞划痕，做到使每一个划痕宽度尽量保持一致，用PBS液洗去细胞碎片，加入含10μg/ml丝裂霉素的无血清培养基，继续培养24小时，在0h和24h拍照，测量划痕宽度。计算24h划痕宽度/0h划痕宽度，数值越小代表细胞迁移能力越强。　　6. Transwell侵袭检测：将转染后H1299、H1975肿瘤细胞加入到Transwell小室中，加入600μl含20%FBS的培养基，常规培养24h，取出Transwell小室，用4%结晶紫溶液染色。随机计数镜下染色阳性透膜细胞数，阳性细胞数越多说明侵袭能力越强。　　7. EdU染色细胞增殖检测：将转染后H1299、H1975肿瘤细胞接种于96孔板中，用EdU试剂盒(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)检测。随机计数第0、2、4、6、8天显微镜下染色阳性细胞数，阳性细胞数越多说明增殖能力越强。　　8. 异种移植裸鼠成瘤实验：将转染后H1299、H1975肿瘤细胞接种于6周龄左右的裸鼠右上肢皮下，每两天用游标卡尺测量肿瘤大小，用最长轴×最短轴×最短轴/2(mm3)计算肿瘤体积，当肿瘤体积达到测量大小(140-160mm3)时，记为第0天。记录之后第5、10、15天肿瘤体积数，第15天处死裸鼠。肿瘤体积数越大说明生长能力越强。　　9. 生物信息学及荧光素酶报告基因检测：我们采用生物信息学miRanda方法(网址：http://www.microrna/home.do)查找miR-300作用的靶基因。将HIF3αmRNA 3’-UTR上的miR-300野生型识别位点和突变型识别位点分别克隆到荧光素酶报告基因开放阅读框的下游。将转染miR-300 和miR-NC的H1299和H1975细胞以每孔105个接种于24孔板中，用野生型（Luc-wtHIF3α）和突变型（Luc-mtHIF3α）构建体进行转染。转染24 h后收集细胞裂解物，对荧光素酶活性通过双荧光素酶报道分析试剂盒（Promega， Madison，WI，USA）进行测量并将其归一化为内部对照β-gal活性。　　10. Western blot 蛋白质印迹分析：使用 RIPA缓冲液提取细胞裂解物，通过SDS-PAGE分离等量的蛋白质，然后进行标准的Western印迹分析。将抗HIF3α、抗Ki67、抗CD31、抗GAPDH抗体分别与膜在4℃孵育过夜，并且使用SuperSignal West Pico底物进行显色。　　11.统计分析：所有数据使用平均数±标准差（?x±SD）进行统计描述，采用SPSS 20.0软件进行单因素方差分析，不同组之间比较使用t检验(双侧)，比较各实验组与对照组的差异，P<0.05表示差异显著，有统计学意义，P<0.01表示差异极显著，有显著统计学意义。为保证实验的重复性，所有的实验均至少重复三次。　　结果：　　1．miR-300在NSCLC肿瘤组织和细胞系中表达降低　　miR-300在NSCLC肿瘤组织中的表达水平明显低于在癌旁正常肺组织中的表达水平（P<0.01)，差异有显著统计学意义，癌旁正常肺组织中miR-300表达水平约为肺癌组织中的1.82倍；miR-300在肺癌细胞系H1299和H1975中的表达水平显著低于在正常肺细胞系Beas-2B中的表达水平（P<0.01)，结果提示miR-300在NSCLC肿瘤组织和细胞系中处于低表达状态。　　2．过表达miR-300可抑制NSCLC肿瘤细胞系的体外增殖、侵袭、迁移能力和体内肿瘤成长能力　　用qRT-PCR检测转染后肿瘤细胞系中miR-300表达水平，结果发现miR-300组miR-300表达水平较miR-NC组明显升高（P<0.01)，差异显著，提示转染成功。　　EdU染色细胞增殖实验结果示接种细胞后2、4、6、8天显微镜下见H1299和H1975细胞中miR-300组EdU染色阳性细胞数明显少于miR-NC组（P<0.01)，结果提示过表达miR-300能抑制NSCLC肿瘤细胞系的体外增殖能力。　　Transwell侵袭实验结果显示H1299和H1975细胞中miR-300组的透膜细胞数明显少于miR-NC组(p<0.01)，H1299细胞中miR-300组透膜细胞数为52.3±6.1个/视野， miR-NC组为192.7±7.4个/视野；H1975细胞中miR-300组透膜细胞数为49.3±6.8个/视野，miR-NC组为198.3±12.2个/视野，结果提示过表达miR-300能抑制NSCLC肿瘤细胞系的体外侵袭能力。　　Wound healing划痕实验结果显示H1299和H1975细胞中miR-300组24h划痕宽度/0h划痕宽度的数值大于miR-NC组(p<0.01)，H1299细胞中miR-300组24h划痕宽度/0h划痕宽度为0.645±0.025，miR-NC组为0.205±0.007；H1975细胞中miR-300组24h划痕宽度/0h划痕宽度为0.481±0.050，miR-NC组为0.193±0.040，结果提示过表达miR-300能抑制NSCLC肿瘤细胞系的体外迁移能力。　　异种移植裸鼠成瘤实验结果显示接种miR-300过表达H1299和H1975细胞系肿瘤生长体积数明显小于接种转染miR-NC肿瘤细胞系(P<0.01），结果提示过表达miR-300能抑制NSCLC肿瘤细胞系的体内肿瘤生长能力。　　3．miR-300直接结合于HIF3αmRNA3’-UTR，miR-300可抑制HIF3α的mRNA及蛋白表达水平　　生物信息学发现HIF3αmRNA3’-UTR的碱基序列与miR-300的碱基序列高度互补配对，初步预测HIF3α是miR-300的靶基因。我们将HIF3αmRNA的3’-UTR野生型区域和突变型区域克隆到荧光素酶报告基因开放阅读框的下游，将荧光素酶载体与β-gal同时转染到稳定表达miR-NC、miR-300的H1299和H1975细胞中，随后以β-gal为参照检测荧光素酶的活性。转染HIF3αmRNA3’-UTR野生型识别位点的miR-300过表达H1299、H1975细胞的荧光素酶活性显著低于miR-NC表达H1299、H1975细胞，提示miR-300抑制了HIF3αmRNA3’-UTR荧光素酶活性。在表达miR-NC或miR-300的H1299、H1975细胞中，携带突变区域的荧光素酶活性未发生改变，提示突变型位点阻断了上述miR-300的抑制作用，荧光素酶活性被完全恢复。本项结果证实HIF3αmRNA的3’-UTR直接靶向识别miR-300。qRT-PCR检测结果示miR-300组HIF3αmRNA表达水平明显低于miR-NC组，Western blot检测结果示miR-300组HIF3α蛋白表达水平明显低于miR-NC组，结果提示过表达的miR-300抑制了HIF3α的mRNA及蛋白表达水平，提示内源性的HIF3α是miR-300的靶点之一。　　4．功能回补实验表明重新引入HIF3α可逆转miR-300对NSCLC的抑制作用　　我们构建了空载体质粒和重新引入HIF3α的质粒，将其转染到miR-300过表达的H1299及H1975肿瘤细胞系中，分为空载体质粒组（miR-300+vector组）和重新引入HIF3α组（miR-300+HIF3α组），用Western blot检测转染后细胞系中HIF3α蛋白表达水平，结果显示miR-300+HIF3α组蛋白表达水平升高，转染成功。　　Transwell 侵袭实验结果发现 miR-300+HIF3α组透膜细胞数明显高于miR-300+vector组(p<0.01)，H1299细胞中miR-300+HIF3α组透膜细胞数为139.7±16.2个/视野，miR-300+vector组为52.3±4.9个/视野；H1975细胞中miR-300+HIF3α组透膜细胞数为154.7±13.8个/视野，miR-300+vector组为57.3±4.7个/视野，结果提示重新引入HIF3α可逆转miR-300对NSCLC肿瘤细胞系侵袭能力的抑制作用。　　Wound healing划痕实验结果显示H1299和1975细胞中miR-300+HIF3α组24h划痕宽度/0h划痕宽度数值小于miR-300+vector组(p<0.01)，H1299-miR-300+HIF3α组24h划痕宽度/0h 划痕宽度为 0.246±0.046 ， H1299-miR-300+vector 组为 0.647±0.003；H1975-miR-300+HIF3α 组 24h 划 痕 宽 度 /0h 划 痕 宽 度 为 0.193±0.004 ， H1975-miR-300+vector组为0.480±0.005，结果提示重新引入HIF3α可逆转miR-300对NSCLC肿瘤细胞系迁移能力的抑制作用。　　裸鼠成瘤实验结果显示miR-300+HIF3α组肿瘤体积数明显高于miR-300+vector组(p<0.01)，结果提示重新引入HIF3α可逆转miR-300对NSCLC肿瘤细胞系体内生长能力的抑制作用。　　Western blot实验结果显示miR-300+HIF3α组HIF3α蛋白表达水平及Ki67、CD31肿瘤生长相关蛋白的表达水平显著高于miR-300+vector组，结果提示重新引入HIF3α可提高HIF3α及肿瘤生长相关蛋白表达水平。　　结论：　　1．miR-300在NSCLC肿瘤组织及细胞系中处于低表达水平。　　2．过表达miR-300可抑制NSCLC肿瘤细胞的体外增殖、侵袭、迁移能力和体内肿瘤生长能力，miR-300在NSCLC中是一种抑癌基因。　　3．HIF3α是miR-300作用的直接靶基因。　　4．重新引入HIF3α可逆转miR-300对NSCLC的抑制作用，miR-300在NSCLC中通过下调HIF3α的表达水平发挥抑癌功能，为NSCLC靶向治疗进一步提供了一定的理论依据。