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脑卒中严重危害我国人口的健康,其发病率高、致残致死率高。由于其治疗时间窗窄,给治疗带来了极大的困难。急性缺血性卒中是脑卒中各种亚型中发病率最高的一种,而尽快恢复血流的再灌注是治疗急性缺血性卒中的最重要方法。随着溶栓和介入治疗的进步,急性缺血性卒中的治疗效果已经有了很大的提高,但由于时间窗窄、副作用大等其他一些因素,治疗效果仍然不理想,这其中很重要的原因是缺血再灌注损伤。恢复脑组织的灌注虽然是治疗急性缺血性脑卒中的目标,但是缺血-再灌注损伤会增加神经元的损伤。多种机制参与缺血-再灌注损伤的病理生理学,包括氧化应激,炎症,血脑屏障破坏,线粒体介导的机制和白细胞浸润。氧化应激是由于再灌注后氧气的供应,产生过量的自由基,这些自由基的量超过了体内抗氧化酶系统的清除能力,从而对细胞产生了损害。NOX,即NADPH氧化酶,是产生ROS的主要酶家族。脂联素是由脂肪细胞表达并分泌。最初,科学家发现脂联素可以增强胰岛素的敏感性,对调节全身的代谢有重要作用。之后的研究发现脂联素对于缺血性脑卒中具有保护作用,但是其具体机制有待阐明。本研究利用线栓法大脑中动脉闭塞模型诱导脑缺血并移除线栓进行再灌注,对象为雄性C57/BL6小鼠,研究APN-P对小鼠脑I/R损伤的保护作用,并探索NOX介导的氧化应激在APN-P脑保护中的作用。本研究将为APN-P的神经保护机制提供新的证据,并为其临床应用提供理论基础。本研究共分为以下三部分:1.氧化应激相关分子在小鼠脑缺血再灌注损伤中的表达变化2.APN-P对于小鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用3.NOX介导的氧化应激在APN-P神经保护机制中的作用及机制第一部分小鼠脑缺血再灌注损伤后氧化应激相关分子的表达变化方法以雄性C57BL/6小鼠为研究对象,采用线栓法MCAO模型并在缺血30分钟后再灌注以建立脑缺血-再灌注损伤模型。将小鼠随机分为六组:Sham组,I/R-6h组,I/R-12h组,I/R-24h组,I/R-48h组,I/R-72h组。先评价各组小鼠的神经功能评分,并于再灌注不同时间后提取小鼠缺血半暗带区组织,通过Western blot检测缺血组织中gp91phox,p47phox,4-HNE和8-OHdG氧化应激相关分子的表达变化。结果1.与Sham组相比,各个I/R组的神经功能评分显著下降,但是各个I/R组之间没有显著差异。2.在I/R后,氧化应激相关蛋白(gp91phox,p47phox,4-HNE和8-OHdG)表达的表达增加,于再灌注24小时达到高峰,随后下降。结论缺血-再灌注后,出现神经功能损伤,氧化应激相关蛋白表达的表达增加,于再灌注24小时达到高峰,随后下降。第二部分APN-P减轻小鼠脑缺血-再灌注损伤方法以雄性C57BL/6小鼠为研究对象,采用线栓法MCAO模型并在缺血30分钟后再灌注24h以建立脑缺血-再灌注损伤模型。将小鼠随机分为六组:Sham组,I/R组,Vehicle+I/R组,APN-P 2.5 mg/kg+I/R组,APN-P 5 mg/kg+I/R组,APN-P 10 mg/kg+I/R组。先评价各组小鼠的神经功能评分,之后测定梗死容积,进行Nissl染色,TUNEL染色和ROS染色,并利用电镜观察神经元超微结构的变化。结果1.与Vehicle+I/R组相比,APN-P 5 mg/kg+I/R组和APN-P 10 mg/kg+I/R组的神经功能评分和梗死容积显著降低,我们选取APN-P 5 mg/kg作为之后研究的剂量。2.Nissl染色的结果提示,APN-P减轻脑缺血-再灌注损伤后神经元损伤。3.TUNEL染色的结果提示,APN-P减轻脑缺血-再灌注损伤后神经元凋亡。4.电镜的结果提示,APN-P减轻脑缺血-再灌注损伤后神经元超微结构的损伤。5.ROS染色的结果提示APN-P减轻脑缺血-再灌注损伤后ROS的生成。结论APN-P减轻缺血-再灌注后神经功能的损伤和梗死容积,并减轻神经元的凋亡和超微结构的损伤,同时降低ROS的生成。第三部分APN-P减轻NOX介导的氧化应激发挥其脑保护作用方法以雄性C57BL/6小鼠为研究对象,采用线栓法MCAO模型并在缺血30分钟后再灌注24h以建立脑缺血-再灌注损伤模型。将小鼠随机分为六组:Sham组,I/R组,Vehicle+I/R组,APN-P+I/R组,Apo+I/R组,APN-P+Apo+I/R组。利用Western blot检测缺血组织中gp91phox,p47phox,4-HNE和8-OHdG氧化应激相关分子的表达变化以及凋亡相关蛋白的表达变化,利用TUNEL染色检测神经元凋亡。结果1.给予APN-P或者Apo处理后,gp91phox,p47phox,4-HNE,8-OHdG的表达水平显著下降（与Vehicle+I/R组相比,P<0.05）。同时,APN-P+I/R组的gp91phox,p47phox和4-HNE的蛋白水平显著低于Apo+I/R组的水平（P<0.05）。在APN-P+I/R和Apo+I/R组之间,8-OHdG的蛋白水平没有显著差异。2.Bax和active caspase-3的蛋白水平在APN-P+I/R,Apo+I/R和APN-P+Apo+I/R组中显著下调（与Vehicle+I/R组相比,P<0.05）。此外,APN-P+I/R组的Bax和active caspase-3蛋白水平较低（与Apo+I/R组相比,P<0.05）。相反,Bcl-2的水平在APN-P+I/R组中表达水平较高（与Apo+I/R组相比,P<0.05）。TUNEL染色的结果提示神经元凋亡的比例在APN-P+I/R,Apo+I/R和APN-P+Apo+I/R组中显著下调（与Vehicle+I/R组相比,P<0.05）。此外,凋亡水平在APN-P+I/R组中更低（与Apo+I/R组相比,P<0.05）。结论APN-P减轻缺血-再灌注后NOX介导的氧化应激是其神经保护作用的重要机制。