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【研究背景及目的】 贲门失弛缓症是一种食管运动功能障碍性疾病，以下食管括约肌(lower esophageal sphincter，LES)张力增高及食管体部正常蠕动消失为特征。主要表现为对液体和／或固体食物的吞咽困难。研究表明，贲门失弛缓症患者LES肌肉本身的收缩和舒张功能是正常的，而支配LES的肌间神经丛中松弛LES的抑制性NOS神经减少或缺乏，使收缩LES的兴奋性胆碱能神经处于相对亢进状态。目前的治疗主要包括药物治疗、内镜下气囊扩张、肉毒杆菌毒素注射、开放式肌切开术和微创肌切开术等，均属姑息性治疗，各有局限性。 间充质干细胞(Mesenchymal Stromal Cells，MSCs)是中胚层来源具有多向分化能力的干细胞，主要存在于结缔组织和器官间质中，以骨髓组织中含量最为丰富，在一定的诱导条件下能分化为多种组织细胞。由于MSCs易于被外源基因转染且稳定表达，并且在一定的条件下可诱导分化为多种细胞，所以被认为是组织工程、细胞及基因治疗理想的靶细胞，因此骨髓MSCs已成为该领域研究的热点之一。 逆转录病毒可以感染增殖期的细胞，并且可以整合至被感染细胞的基因组中得以长期稳定表达，对宿主细胞没有毒性作用。本实验以逆转录病毒pMSCVpuro为载体，构建携带eNOS基因的重组复制缺陷型逆转录病毒表达载体，同时分离培养猫骨髓MSCs，研究eNOS在MSCs中的表达，为贲门失弛缓症的治疗提供新思路。 【实验方法】 一、重组逆转录病毒pMSCVpuro-eNOS的构建 将质粒pcDNA3-eNOS转化、扩增、鉴定后，用EcoR Ⅰ酶切获得4.1 kb的目的基因eNOS cDNA片段。逆转录病毒载体pMSCVpuro用EcoR Ⅰ酶切后，用CIAP进行去磷酸化处理，然后与eNOS cDNA片段连接。连接产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，利用Amp筛选抗性克隆，获得正向插入的pMSCVpuro-eNOS，对重组质粒进行测序。利用脂质体介导法将pMSCVpuro-eNOS转染