研究背景非酒精性脂肪性肝病(Nonalcoholic Fatty Liver Disease, NAFLD)是指在无过多酒精摄入同时排除病毒性、药物性、全胃肠外营养、先天性及自身免疫性等损肝因素的前提下出现肝细胞内脂质沉积,包括一系列病变,从单纯性脂肪肝(simple hepatic steatosis)到非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis, NASH),后者可进一步发展为肝纤维化、肝硬化,甚至是肝细胞癌。随着西方生活方式的流行和生活水平的提高,NAFLD发病率逐年上升。因此NAFLD已经成为危害健康的重大卫生问题。既往认为单纯性脂肪肝阶段为良性病变,所以对其防治不够重视。然而研究发现约20%的单纯性脂肪肝患者可以发展成NASH;与正常肝脏相比,单纯性脂肪肝阶段的肝脏较易受到药物、工业毒物、酒精、缺血以及病毒感染等伤害,导致其他类型肝病发生；单纯性脂肪肝可以加重胰岛素抵抗和代谢紊乱；单纯性脂肪肝也是糖尿病进展、动脉粥样硬化加重和血管功能失调的独立危险因子。因此积极干预单纯性脂肪肝对NAFLD的早期防治意义重大。然而NAFLD的发病机制目前尚未完全阐明,故治疗尚停留在减少危险因素及饮食、运动的干预,缺乏特别有效的药物治疗。胰高血糖素样肽-1(Glucagon-Like Peptide-1, GLP-1)由小肠L细胞分泌,具有葡萄糖依赖性的促胰岛素分泌作用,同时还有增加饱腹感、减慢胃排空、减轻体重及促进胰岛p细胞增殖等作用。目前的研究发现人类肝细胞上存在GLP-1的受体,并且GLP-1能够降低肝细胞内的脂质沉积。但GLP-1是否能够在单纯性肝细胞脂肪变性阶段起作用及其作用机制如何,尚需进一步研究。自噬(Autophagy)是真核细胞中普遍存在的一种物质降解途径,通过自噬-溶酶体介导,清除自身多余的蛋白质以及受损的细胞器,促进细胞内物质的循环利用,从而维持内环境稳态。最近的研究表明自噬参与脂质的降解。GLP-1类似物能够减轻脂肪酸诱导的肝细胞脂质沉积,与自噬相关的标志物Beclin-1和LC3B-Ⅱ生成增加,电镜观察到自噬体数量增加。由此推测自噬很可能参与了GLP-1减轻肝细胞脂质沉积的过程,但自噬是否在单纯性脂肪肝的发生发展中起作用尚需进一步的研究。第一部分肝细胞单纯性脂肪变性模型的构建及鉴定目的：构建肝细胞单纯性脂肪变性模型,然后进行鉴定以判断能否模拟人体单纯性脂肪肝的病理特点。方法：常规10%胎牛血清DMEM培养基培养人正常肝细胞系L-02细胞,待细胞融合度达70-80%时进行消化传代。然后正常组换用新鲜的完全培养基,模型组换用含1mmol/L游离脂肪酸混合物(油酸：棕榈酸=2：1)的完全培养基,继续培养24小时,分别进行油红O染色、细胞内甘油三酯测定评价细胞内脂质沉积情况,CCK-8法检测细胞活力,细胞内丙二醛测定评价氧化应激情况,Hoechst33342染色、Annexin V-FITC/PI双染色法流式细胞检测及Western blot检测cleaved caspase-3蛋白的表达以比较两组细胞的凋亡情况。结果：油红O染色显示模型组细胞内可见大量红色脂滴形成,而正常组未见明显脂滴形成。细胞内甘油三酯测定证实模型组细胞内甘油三酯含量明显高于正常组(p<0.01)。两组在细胞活力、氧化应激方面均无明显差异。Hoechst33342染色结果表明两组细胞凋亡均不明显。Annexin V-FITC/PI双染色法流式细胞检测结果显示两组细胞的早期凋亡比例无显著性差异。Westernblot检测显示两组细胞cleaved caspase-3的蛋白表达水平均很低。小结：使用含1mmol/L游离脂肪酸混合物(油酸：棕榈酸=2：1)的完全培养基诱导L-02细胞24小时能够构建类似人单纯性脂肪肝病理改变的肝细胞单纯性脂肪变性模型。第二部分自噬在GLP-1干预肝细胞单纯性脂肪变性中的作用目的：观察利拉鲁肽(GLP-1长效类似物)干预对肝细胞单纯性脂肪变性细胞模型脂质沉积的影响及自噬在这一过程中的作用。方法：取L-02细胞常规培养24小时后更换培养基并加入适当体积的注射用水,继续培养24小时,作为正常组。另外按照第一部分方法构建肝细胞单纯性脂肪变性模型,然后分为5组：模型组、利拉鲁肽10nM组、利拉鲁肽100nM组、利拉鲁肽100nM+3-Methyladenine (3-MA,3-甲基腺嘌呤,自噬抑制剂)组、雷帕霉素(Rapamycin,自噬增强剂)组,并依次给予相应的处理,继续培养24小时。取上述6组细胞,分别进行油红O染色、细胞内甘油三酯测定评价细胞内脂质沉积程度的变化,RT-PCR、Westernblot检测细胞内Beclin-1、p62、LC3B的mRNA和蛋白水平的变化,电镜观察细胞内自噬体情况。结果：1.油红O染色显示利拉鲁肽干预后,细胞内脂滴数量较模型组明显减少,其中100nM组更为明显。同时使用利拉鲁肽100nM和自噬抑制剂3-MA进行干预时,细胞内的脂滴数量较单独使用利拉鲁肽100nM增加,但仍较模型组少。自噬增强剂雷帕霉素干预同样能够减少细胞内的脂滴数量。细胞内甘油三酯测定的结果与油红O染色结果基本一致。2. RT-PCR的结果表明各组Beclin-1mRNA表达水平无明显差异。P62mRNA表达水平在各组(除正常组外)间无明显差异。模型组LC3BmRNA表达水平低于正常组,但没有明显差异。利拉鲁肽10nM组、100nM组LC3B mRNA表达水平均高于模型组,其中100nM组有显著性差异(p<0.05)。而利拉鲁肽100nM+3-MA组LC3B mRNA表达水平明显低于利拉鲁肽100nM组(p<0.05)。雷帕霉素干预后LC3B mRNA表达水平明显高于模型组(p<0.05)。Western blot检测各组Beclin-1、p62以及LC3BII的蛋白表达水平,结果显示与RT-PCR变化大体一致。使用Bafilomycin阻断自噬体和溶酶体的融合,通过比较阻断前后LC3BII蛋白表达量的变化来观察各组自噬潮的大小,结果显示：模型组低于正常组,利拉鲁肽100nM组明显高于模型组,而利拉鲁肽100nM+3-MA组低于利拉鲁肽100nM组,仍高于模型组。雷帕霉素组明显高于模型组。3.电镜观察显示正常组L-02细胞内可见较多线粒体,少量自噬体。模型组细胞内见大量脂质空泡,未见自噬体。利拉鲁肽100nM组细胞内脂质空泡较少,见大量自噬体。而利拉鲁肽100nM+3-MA组细胞内自噬体数量较少,脂质空泡较多,有融合成片现象。雷帕霉素组细胞内见较多自噬体和少量脂质空泡。小结：利拉鲁肽能够减轻肝细胞单纯性脂肪变性细胞模型的脂质沉积,并且有一定的剂量依赖性。利拉鲁肽减轻肝细胞脂质沉积的过程中存在自噬增强的现象,而抑制自噬可使利拉鲁肽减轻肝细胞脂质沉积的作用减弱。单独增强自噬也能减轻肝细胞脂质沉积。由此推测自噬可能是利拉鲁肽减轻肝细胞单纯性脂肪变性模型脂质沉积的机制之一。全文结论1.使用lmmol/L游离脂肪酸混合物(油酸：棕榈酸=2：1)诱导人正常肝细胞系L-02细胞24小时,能够构建类似人单纯性脂肪肝病理改变的细胞模型；2.利拉鲁肽能够减轻L-02细胞单纯性脂肪变性模型中的脂质沉积,并且具有一定的剂量依赖性；3.自噬可能是利拉鲁肽减轻单纯性脂肪变性细胞模型脂质沉积的机制之一。