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目的 神经母细胞瘤(Neuroblastoma，NB)是儿童期常见的起源于交感神经系统的颅外恶性实体肿瘤。在联合应用手术、化疗及放疗治疗后，NB患儿的生存率仍小于30％。在长期生存患者中，90％肿瘤有较高分化，属于Ⅰ和Ⅱ期，只有10％肿瘤分化较差，属于Ⅲ和Ⅳ期。NB具有自行消退逆转的独特生物学特性，因而如何诱导NB细胞在体内外发生分化逆转成为国内外学者关注的热点。 Trk癌基因家族是神经营养素(NT)的高亲和性受体，在结构与功能相关方面至少包括3个成员：TrkA、TrkB和TrkC。有证据表明TrkA的表达与临床预后密切相关。早期(Ⅰ和Ⅱ期)及多数婴儿期NB无N-myc基因扩增，常有TrkA高表达。而晚期NB(Ⅲ和Ⅳ期)及有N-myc扩增者TrkA的表达则降低。由此可见TrkA癌基因的表达情况是一个独立的预后判定指标。 本课题使用γ干扰素(IFN-γ、神经生长因子(NGF)及联合应用IFN-γ和NGF分别作为分化诱导剂，观察不同诱导剂诱导人NB细胞系SMS-KCNR细胞分化的效果，进而探索TrkA癌基因表达及NGF／TrkA信号传导通路对NB细胞增殖抑制和诱导分化的作用机制。 实验材料 人NB细胞系SMS-KCNR由美国国立卫生研究院Carol J.Thiele教授赠送。 实 验 方 法 一、细胞培养： 37℃水浴复苏人NB细胞系SMS－KCNR细胞，并立即将细胞液移人含有15％胎牛血清上皿IU／d青霉素＊00地d链霉素的RPMI－1640培养液中，置于 37℃3％CO卜100％湿度的H氧化碳培养箱中培养，每3—4天换液一次，当细胞覆盖瓶底面积80％以上时，用吸管吹开分瓶传代。 二、实验分组： l、将＊－vJGF分别用去离子水溶解，使其终浓度分别为5000IU／Inl和4．5 x 10、牙Inl，然后用 RPMI－1640培养液配成分另含25lU／nl IFN－Y的培养液、含 100ng／nil NGF的培养液、含25IU／rnl IFN－y和 100ng／Inl NGF的培养液，4℃保存。 2、使用时对照组（不加药组）直接换人正常培养液，甲组用含25IU／d IFN－y的培养液换液、乙组用含 100ng／Inl NGF的培养液换液、丙组用含25IU／IIFN－y和 100ng／llil NGF的培养液换液。 三、观察指标： l、活细胞计数：取对数生长期SMS－KCNR细胞，接种至24IL培养板，细胞浓度为 IX 10’个／Inl，分别于w－YJGF及联合应用互FN－Y和NGF处理后OJ斤二0天，用O．2％台盼兰拒染实验判定细胞活性，不着色细胞为活细胞，细胞计数器计数，每份标本双盲法计数4次。 2、细胞形态学观察：SMS－KCNR细胞中用作分化研究的细胞以 lxlo‘什cm‘数目接种于培养瓶中。分别在加药处理后 0。3在＊ 天用倒置相差显微镜观察细胞形态学改变。观察时对每瓶细胞选取4个不同视野的200个细胞，双盲法计数分化细胞刻 ·2·未分化细胞数。 3、1＊N－Y、＊＊F及联合应用IFN－Y和＊＊F对皿AmRNA表达的影响： 门）提取各组细胞总RNA，逆转录mRNA为cDNA； （二）PCR扩增逆转录产物cDNA（弓物为528hP）及p－achn（686hp）留用内参照； 门）二．5％琼脂－甲醛凝胶电泳TrkA PCR产物小－achn及Mark，存人电脑摄像系统并照相，利用电脑成像系统计算电泳后泳带密度。 四、数据处理：实验结果以均数。标准差（X。SD）表示，两均数比较采用 t检验，细胞形态学分化采用 X‘检验。 实 验 结 果 一、IFN－y、NGF及联合应用 IFN－Y和 NGF又 SMS－KCNR细胞增殖的影响： 在整个观察过程中，对照组的活细胞数3天后明显增多并随着培养时间延长而增多。前3天，甲、乙、丙各组的活细胞数与对照组相比均无明显差别（P＞0．05人第6天，甲组与丙组的活细胞数与对照组相比差值有统计学意义汀＜0．05入而乙组与对照组活细胞数相比无明显差别汀＞O．05人第IO天，甲组与对照组相比差值有统计学意义u＜0．05厂乙组与对照组相比活细胞数仍无明显差别汀＞0．05厂而丙组与对照组、甲组和乙组相比均有极显著性差别u＜0刀门。 二、IFN－Y、NGF及联合应用IFN－Y和NGF对SMS－KCNR细胞形态学分化的影响： 在整个观察过程中，各实验组分化细胞百分率汀DC）随时间增加均明显增加。前3天，甲、乙、丙各组细胞PDC与对照组PDC ·3·相比无明显差别（P＞0．05人第6天，甲组和乙组与对照组相比细胞分化均无明显差别瞩＞O．05入丙组＊m与对照组相比有统计学意义沪＜0．05八第10天，甲组与对照组相比差值有统计学意义u＜O．05厂而乙组与对照组相比仍无明显差别（P＞O．05厂丙组与对照组相比有极显著性差别（P＜0．01入丙组与甲组相比有明显差别（P＜0．05）。 三、IFN－Y、NGF及联合应用IFN－Y和NGF处理对TrkAmRNA表达的影向： RNA PCR半定量分析显示在处理第 10天，甲组TrkA表达与对照组相比明显增强汀＜0．01厂乙组TrM表达与对照组相比无明显差别瞩＞0．05入而丙组Tr卜A表达明显下降汀＜0?