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目的 神经母细胞瘤(Neuroblastoma,NB)是儿童期常见的起源于交感神经系统的颅外恶性实体肿瘤。在联合应用手术、化疗及放疗治疗后,NB患儿的生存率仍小于30%。在长期生存患者中,90%肿瘤有较高分化,属于Ⅰ和Ⅱ期,只有10%肿瘤分化较差,属于Ⅲ和Ⅳ期。NB具有自行消退逆转的独特生物学特性,因而如何诱导NB细胞在体内外发生分化逆转成为国内外学者关注的热点。 Trk癌基因家族是神经营养素(NT)的高亲和性受体,在结构与功能相关方面至少包括3个成员:TrkA、TrkB和TrkC。有证据表明TrkA的表达与临床预后密切相关。早期(Ⅰ和Ⅱ期)及多数婴儿期NB无N-myc基因扩增,常有TrkA高表达。而晚期NB(Ⅲ和Ⅳ期)及有N-myc扩增者TrkA的表达则降低。由此可见TrkA癌基因的表达情况是一个独立的预后判定指标。 本课题使用γ干扰素(IFN-γ、神经生长因子(NGF)及联合应用IFN-γ和NGF分别作为分化诱导剂,观察不同诱导剂诱导人NB细胞系SMS-KCNR细胞分化的效果,进而探索TrkA癌基因表达及NGF/TrkA信号传导通路对NB细胞增殖抑制和诱导分化的作用机制。 实验材料 人NB细胞系SMS-KCNR由美国国立卫生研究院Carol J.Thiele教授赠送。 实 验 方 法 一、细胞培养: 37℃水浴复苏人NB细胞系SMS-KCNR细胞,并立即将细胞液移人含有15%胎牛血清上皿IU/d青霉素*00地d链霉素的RPMI-1640培养液中,置于 37℃3%CO卜100%湿度的H氧化碳培养箱中培养,每3—4天换液一次,当细胞覆盖瓶底面积80%以上时,用吸管吹开分瓶传代。 二、实验分组: l、将*-vJGF分别用去离子水溶解,使其终浓度分别为5000IU/Inl和4.5 x 10、牙Inl,然后用 RPMI-1640培养液配成分另含25lU/nl IFN-Y的培养液、含 100ng/nil NGF的培养液、含25IU/rnl IFN-y和 100ng/Inl NGF的培养液,4℃保存。 2、使用时对照组(不加药组)直接换人正常培养液,甲组用含25IU/d IFN-y的培养液换液、乙组用含 100ng/Inl NGF的培养液换液、丙组用含25IU/IIFN-y和 100ng/llil NGF的培养液换液。 三、观察指标: l、活细胞计数:取对数生长期SMS-KCNR细胞,接种至24IL培养板,细胞浓度为 IX 10’个/Inl,分别于w-YJGF及联合应用互FN-Y和NGF处理后OJ斤二0天,用O.2%台盼兰拒染实验判定细胞活性,不着色细胞为活细胞,细胞计数器计数,每份标本双盲法计数4次。 2、细胞形态学观察:SMS-KCNR细胞中用作分化研究的细胞以 lxlo‘什cm‘数目接种于培养瓶中。分别在加药处理后 0。3在* 天用倒置相差显微镜观察细胞形态学改变。观察时对每瓶细胞选取4个不同视野的200个细胞,双盲法计数分化细胞刻 ·2·未分化细胞数。 3、1*N-Y、**F及联合应用IFN-Y和**F对皿AmRNA表达的影响: 门)提取各组细胞总RNA,逆转录mRNA为cDNA; (二)PCR扩增逆转录产物cDNA(弓物为528hP)及p-achn(686hp)留用内参照; 门)二.5%琼脂-甲醛凝胶电泳TrkA PCR产物小-achn及Mark,存人电脑摄像系统并照相,利用电脑成像系统计算电泳后泳带密度。 四、数据处理:实验结果以均数。标准差(X。SD)表示,两均数比较采用 t检验,细胞形态学分化采用 X‘检验。 实 验 结 果 一、IFN-y、NGF及联合应用 IFN-Y和 NGF又 SMS-KCNR细胞增殖的影响: 在整个观察过程中,对照组的活细胞数3天后明显增多并随着培养时间延长而增多。前3天,甲、乙、丙各组的活细胞数与对照组相比均无明显差别(P>0.05人第6天,甲组与丙组的活细胞数与对照组相比差值有统计学意义汀<0.05入而乙组与对照组活细胞数相比无明显差别汀>O.05人第IO天,甲组与对照组相比差值有统计学意义u<0.05厂乙组与对照组相比活细胞数仍无明显差别汀>0.05厂而丙组与对照组、甲组和乙组相比均有极显著性差别u<0刀门。 二、IFN-Y、NGF及联合应用IFN-Y和NGF对SMS-KCNR细胞形态学分化的影响: 在整个观察过程中,各实验组分化细胞百分率汀DC)随时间增加均明显增加。前3天,甲、乙、丙各组细胞PDC与对照组PDC ·3·相比无明显差别(P>0.05人第6天,甲组和乙组与对照组相比细胞分化均无明显差别瞩>O.05入丙组*m与对照组相比有统计学意义沪<0.05八第10天,甲组与对照组相比差值有统计学意义u<O.05厂而乙组与对照组相比仍无明显差别(P>O.05厂丙组与对照组相比有极显著性差别(P<0.01入丙组与甲组相比有明显差别(P<0.05)。 三、IFN-Y、NGF及联合应用IFN-Y和NGF处理对TrkAmRNA表达的影向: RNA PCR半定量分析显示在处理第 10天,甲组TrkA表达与对照组相比明显增强汀<0.01厂乙组TrM表达与对照组相比无明显差别瞩>0.05入而丙组Tr卜A表达明显下降汀<0?