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背景和目的:临床上结肠癌的化疗是重要的治疗方法,其方案常含有铂类药物,而化疗耐药可影响结肠癌疗效和预后,其发生机制与基因异常表达有关。高尔基磷酸化蛋白3(GOLPH3)在结肠癌组织中存在过表达,可促进结肠癌细胞的增殖,与预后不良相关。目前,GOLPH3基因的异常表达与结肠癌对铂类耐药相关性尚不明确。本研究利用si RNA干扰技术,在顺铂处理下,通过体外结肠癌细胞实验和动物模型,探讨GOLPH3基因过表达参与结肠癌细胞的顺铂耐药及其作用机制。方法:1.细胞分组:1.1顺铂实验浓度的选择:HT29结肠癌细胞分为4组,分别加入0、2.5、5、10μM浓度顺铂,依据Western Blot检测各相关蛋白结果选择后续顺铂实验浓度。1.2实验分组:(1)对照组:人结肠癌HT29细胞;(2)转染组:si RNA沉默GOLPH3基因的HT29细胞;(3)实验组1:经Cisplatin处理的HT29细胞;(4)实验组2:经Cisplatin处理的si RNA-GOLPH3转染细胞;(5)实验组3:经Cisplatin和ERK1/2抑制剂PD98059处理的HT29细胞。2.细胞转染:利用si-RNA干扰技术沉默HT29细胞GOLPH3基因的表达,RT-PCR和Western blot方法检测HT29细胞转染si RNA-GOLPH3后的沉默效果。3.各结肠癌细胞组在含对应浓度的顺铂的培养基中分别培养24h。4.MTT法和平板克隆形成实验、瘤球形成实验分别检测各组细胞增殖、成瘤情况,Annexin V-FITC/PI流式细胞实验检测各组细胞凋亡。5.Western Blot检测各组细胞GOLPH3、P-gp、β-catenin、ERK1/2、p ERK1/2蛋白的表达水平。6.将16只裸鼠随机分为4组,每组4只,分为对照组、转染组、实验组1、实验组2,分别腋窝皮下注射相应癌细胞,观察30天内成瘤情况。7.比较体外各组细胞中增殖、成瘤、凋亡情况及各相应蛋白表达的差异,计算各组裸鼠腋窝下转移瘤体积大小的差别判断GOLPH3基因与结肠癌细胞铂类化疗耐药的关系并分析探讨其机制。结果:1.HT29结肠癌细胞转染效果1.1 GOLPH3表达检测:与对照组相比,转染组细胞中的GOLPH3 m RNA的相对表达量明显降低,差异有统计学意义(P<0.01)。同时,Western Blot结果显示:转染组中GOLPH3蛋白表达低于对照组,差异有统计学意义(P<0.01)。1.2 MTT法检测HT29细胞增殖:转染组细胞OD490值低于对照组的OD490值,差异有统计学意义(P<0.01)。平板克隆形成实验的结果:转染组细胞集落数低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。1.3 Annexin V-FITC/PI流式细胞实验检测细胞凋亡:转染组的细胞凋亡率明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.01)。2.GOLPH3基因参与调控HT29结肠癌细胞对顺铂化疗耐药2.1随顺铂浓度增加,HT29细胞中P-gp、GOLPH3、p ERK1/2、β-catenin蛋白表达量亦同步升高,当顺铂浓度为10μM,与对照组(浓度为0μM)相比,各蛋白表达量差异最为显著(P<0.01)。因此后续顺铂干预实验其浓度选为10μM。2.2在顺铂处理条件下,MTT、克隆形成及瘤球形成实验结果分别显示实验组2的OD490值、细胞集落数、瘤球数均显著低于实验组1,差异均有统计学意义(P<0.001)。2.3在顺铂处理条件下,Annexin V-FITC/PI流式细胞实验结果显示实验组2的细胞凋亡率显著高于实验组1,差异有统计学意义(P<0.001)。3.GOLPH3基因参与HT29细胞对顺铂化疗耐药的机制探讨3.1实验组2的GOLPH3、P-gp、p ERK1/2、β-catenin蛋白显著低于实验组1,差异有统计学意义(P<0.01)。3.2实验组3中β-catenin、P-gp的蛋白相对表达量对比实验组1均显著降低,差异有统计学意义(P<0.01)。4.动物成瘤实验验证沉默GOLPH3表达可提高HT29细胞对顺铂化疗的敏感性裸鼠移植瘤终止观察时,转染组、实验组1、实验组2裸鼠腋窝皮下移植瘤体的体积均显著低于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。实验组2裸鼠自15天后其瘤体体积均小于同期实验组1裸鼠的瘤体体积,差异均有统计学意义(P<0.001)。结论:1、GOLPH3的过表达可参与HT29结肠癌细胞对顺铂化疗的耐药;2、GOLPH3的过表达可通过激活Wnt/β-catenin及MAPK/ERK细胞信号通路而促进HT29结肠癌细胞对顺铂化疗的耐药。3、沉默GOLPH3基因的表达可一定程度上逆转HT29结肠癌细胞对顺铂化疗的耐药。