前列腺增生症是老年男性常见病和多发病,70岁以上男性的发病率可高达80%。代谢综合征是一组心血管疾病的危险因素,包括胰岛素抵抗/高胰岛素血症,内脏性肥胖,脂类代谢异常,高血压,内皮功能异常,全身性炎症等。胰岛素抵抗指的是机体对胰岛素敏感组织对胰岛素的反应性降低,胰腺β细胞代偿性地分泌更多的胰岛素。它与肥胖和高脂饮食密切相关,是代谢综合征的核心环节,是Ⅱ型糖尿病、肥胖及原发性高血压等疾病的共同发病基础。流行病学研究表明,代谢综合征人群中前列腺增生症的发病率增高,但这一学说目前尚未取得一致意见。匹格列酮是一种胰岛素增敏剂,用于治疗Ⅱ型糖尿病。动物模型研究发现高胰岛素血症导致前列腺细胞增殖,匹格列酮可反馈性降低血浆胰岛素分泌水平,通过过氧化物酶体增生物激活受体γ(PPARγ)信号途径起作用,从而改善前列腺增生。白藜芦醇是一种自然多酚,存在于多种植物中,具有抗炎、抗肿瘤和抗氧化剂特性,可对抗高热量饮食喂养的动物肥胖和胰岛素抵抗,但白藜芦醇对于代谢综合征引起的前列腺增生是否有作用,目前还未见报道。本课题选用wistar大鼠,建立大鼠代谢综合征模型,观察代谢综合征对前列腺的影响,了解高胰岛素血症和中心性肥胖能否导致前列腺增生症;并观察应用白藜芦醇干预,能否改善高脂饮食诱导的前列腺增生,同时与匹格列酮相比较,探讨其是否通过改善高胰岛素血症而改善前列腺增生,及其是否参与PPARγ途径,以及通过PPARγ下游何种信号通路起作用,从而探讨代谢综合征诱发前列腺增生症的机制及白藜芦醇治疗效果。第一部分代谢综合征模型建立采用健康雄性SPF级wistar大鼠,以60%高脂饮食喂养,建立代谢综合征模型,为进一步研究代谢综合征导致前列腺增生及白藜芦醇对前列腺增生的影响奠定基础。是否出现胰岛素抵抗这一代谢综合征核心要素为造模成功的标志。方法:健康雄性SPF级wistar大鼠20只,适应性喂养1周后随机分作两组:高脂喂养组(n=15)应用60%纯化型高脂饲料喂养,正常喂养组(n=5)应用与60%纯化型高脂饲料匹配的对照饲料喂养,持续9周。第9周末,测定两组动物空腹血脂水平、胰岛素水平及血糖浓度。稳态模型胰岛素抵抗评估法(HOMA-IR)用于评价个体的胰岛素抵抗水平。HOMA-IR=空腹血糖(FPG,mmol/L)×空腹胰岛素(FINS,u IU/ml)/22.5。所有数值均用均数±标准差(`x±SD)表示,两组间比较采用t检验。结果:1体重高脂喂养组与正常喂养组大鼠体重(g)分别为313.73±25.04、298±27.72,两组之间无统计学差异(P>0.05)。2生化指标2.1血脂水平高脂喂养组及正常喂养组空腹血浆总胆固醇(mmol/l)分别为1.84±0.24、1.83±0.32;高脂喂养组及正常喂养组总甘油三酯(mmol/l)分别为1.08±0.34、1.45±0.42;高脂喂养组及正常喂养组高密度脂蛋白(mmol/l)分别为0.47±0.07、0.48±0.08;高脂喂养组及正常喂养组低密度脂蛋白(mmol/l)分别为0.33±0.06、0.31±0.11;高脂喂养组及正常喂养组极低密度脂蛋白(mmol/l)分别为0.49±0.15、0.66±0.19;两组间各项脂类参数均无显著性差异(P>0.05)。2.2葡萄糖代谢相关指标高脂喂养组及正常喂养组空腹血浆胰岛素水平(u IU/ml)分别为30.79±5.51、21.61±4.53,高脂喂养组明显高于正常喂养组,两者比较有统计学差异(P<0.05);高脂喂养组及正常喂养组空腹血糖(mmol/l)分别为4.85±0.72、4.28±0.26,两者比较无统计学差异(P>0.05)。高脂饮食喂养组和正常喂养组HOMA-IR指数分别为6.66±1.69、4.09±0.73,高脂喂养组明显高于正常喂养组,两组相比有显著性差异(P<0.05)。小结:高脂喂养组大鼠的血浆胰岛素浓度及胰岛素抵抗指数明显高于对照组,这说明:通过高脂喂养可以导致大鼠的胰岛素水平明显升高,胰岛素抵抗指数明显升高,标志着代谢综合征核心要素胰岛素抵抗建立。第二部分代谢综合征对前列腺增生的影响高脂喂养建立代谢综合征模型,测定实验终末动物血糖、血脂水平,测量大鼠体重、前列腺绝对重量、前列腺指数、内脏脂肪重量等,观察高脂喂养模拟的高胰岛素血症及内脏性肥胖,能否导致大鼠前列腺增生症,为后续研究奠定基础。方法:代谢综合征组大鼠用高脂喂养健康SPF级wistar大鼠(n=5)9周建立代谢综合征模型后,继续给予60%纯化型高脂饲料4周;同期开始、以与高脂饲料匹配的对照饲料喂养的大鼠为对照组(n=5),继续给予60%纯化型高脂饲料匹配的对照饲料4周(第11-14周)。第14周末,取材前12小时禁食,测体重,测定血糖,7%水合氯醛(0.4ml/100g)麻醉,腹主动脉取血备测胰岛素和血脂,然后取前列腺、内脏脂肪(左侧睾丸附睾周围脂肪+脊柱左侧腹膜后脂肪代替双侧睾丸附睾周围脂肪+肠系膜脂肪+肾周脂肪).剔除前列腺表面脂肪滤纸吸干水分后称重。内脏脂肪吸干水分后称重。计算前列腺指数(前列腺重量/大鼠体重)。前列腺标本分作两份,左腹侧叶进行组织学检查。所有数值均用`x±SD来表示,采用T检验的统计学方法分析所得数据。结果:1生化指标1.1血脂水平1.1.1血浆总胆固醇空白对照组、代谢综合征组的血浆总胆固醇(mmol/l)分别为:1.80±0.24、2.20±0.18,代谢综合组高于对照组,两组间存在统计学差异(P<0.05)。1.1.2血浆甘油三酯空白对照组、代谢综合征组的血浆总甘油三酯(mmol/l)分别为:0.74±0.36、0.90±0.29,两组间无统计学差异(P>0.05)。1.1.3血浆高密度脂蛋白空白对照组、代谢综合征组的血浆高密度脂蛋白(mmol/l)分别为:0.51±0.05、0.44±0.06,两组间无统计学差异(P>0.05)。1.1.4血浆低密度脂蛋白空白对照组、代谢综合征组的血浆低密度脂蛋白(mmol/l)分别为0.28±0.09、0.34±0.05,提示两组间无统计学差异(P>0.05)。1.1.5血浆极低密度脂蛋白空白对照组、代谢综合征组的血浆极低密度脂蛋白(mmol/l)分别为0.33±0.16、0.41±0.14,两组相比无统计学差异(P>0.05)。1.2糖代谢相关指标1.2.1空腹血浆胰岛素空白对照组、代谢综合征组的空腹血浆胰岛素(u IU/ml)分别为23.94±2.54、35.51±7.00,代谢综合征组明显高于对照组,两组间有统计学差异(P<0.05)。1.2.2空腹血糖空白对照组、代谢综合征组的空腹血糖(mmol/l)分别为4.12±0.38、4.68±0.45,两组间未见统计学差异(P>0.05)。1.2.3 HOMA-IR空白对照组、代谢综合征组的HOMA-IR分别为:4.37±0.54、7.38±1.60。代谢综合征组明显高于对照组,各组间存在统计学差异(P<0.05)。2身体测量参数2.1大鼠体重空白对照组、代谢综合征组大鼠的体重(g)分别为326.20±32.27、345.80±35.10,两组间无统计学差异(P值均>0.05)。2.2前列腺绝对重量空白对照组、代谢综合征组的前列腺绝对重量(g)分别为0.41±0.07、0.54±0.07,代谢综合征组明显高于空白对照组,有统计学差异(P<0.05)。2.3内脏脂肪重量空白对照组、代谢综合征组大鼠的内脏脂肪重量(g)分别为6.87±1.92、14.10±4.16,代谢综合征组明显高于空白对照组,两组间存在统计学差异(P<0.05)。2.4前列腺指数空白对照组、代谢综合征组大鼠的前列腺指数(mg/g)分别为:1.26±0.16、1.54±0.18,代谢综合征组明显高于空白对照组,两组间有统计学差异(P<0.05)。3组织学变化与空白对照组相比,代谢综合征组动物前列腺腺腔内可见大量分泌物,腺上皮细胞层数增多,向腔内出芽明显,间质明显增多,且出现大量的脂肪细胞。由上可知,高脂喂养大鼠的胰岛素水平、胰岛素抵抗指数及内脏脂肪重量均显著高于对照组,表明高脂喂养可以形成代谢综合征的最基本的两要素:胰岛素抵抗/高胰岛素血症和内脏性肥胖。出现胰岛素抵抗/高胰岛素血症和内脏性肥胖的大鼠,其前列腺绝对重量、前列腺指数均较对照组增高,说明代谢综合征可以诱导出现前列腺增生症。第三部分白藜芦醇对前列腺增生的治疗作用高脂喂养建立代谢综合征模型,应用白藜芦醇和匹格列酮干预,测定实验终末动物血糖、血脂水平,测量大鼠体重、前列腺绝对重量、前列腺指数、内脏脂肪重量等,观察应用白藜芦醇,能否改善高胰岛素血症及内脏性肥胖,能否改善该因素导致的前列腺增生症,同时与匹格列酮相比较。方法:适应性喂养1周后,高脂喂养健康SPF级wistar大鼠9周建立代谢综合征模型,成模动物随机分为代谢综合征组(metabolic syndrome group Mets)、白藜芦醇组(resveratrol group RES)、匹格列酮组(pioglitazone group PIO),每组各5只,分别给予60%纯化型高脂饲料、60%纯化型高脂饲料+白藜芦醇(resveratrol 50mg?kg-1,每天一次)、60%纯化型高脂饲料+匹格列酮(pioglitazone 20 mg?kg-1,每天一次),共4周(第11-14周)。第14周末,取材前12小时禁食,测体重,测定血糖,7%水合氯醛(0.4ml/100g)麻醉,腹主动脉取血备测胰岛素和血脂,然后取前列腺、前列腺周围脂肪、内脏脂肪(左侧睾丸附睾周围脂肪+脊柱左侧腹膜后脂肪代替双侧睾丸附睾周围脂肪+肠系膜脂肪+肾周脂肪),剔除前列腺表面脂肪滤纸吸干水分后称重。内脏脂肪吸干水分后称重。计算前列腺指数(前列腺重量/大鼠体重)。前列腺标本分作两份,左腹侧叶进行组织学检查。所有数值均用`x±SD来表示,采用单因素方差分析的统计学方法分析所得数据。结果:1生化指标1.1血脂水平1.1.1血浆总胆固醇代谢综合征组、白藜芦醇组及匹格列酮组的血浆总胆固醇(mmol/l)分别为:2.20±0.18、1.72±0.22、2.05±0.33,两两比较,白藜芦醇组与代谢综合征组比较总胆固醇水平降低,有统计学差异(P<0.05);其他两两比较无统计学差异(P>0.05)。1.1.2血浆甘油三酯代谢综合征组、白藜芦醇组及匹格列酮组的血浆总甘油三酯(mmol/l)分别为:0.90±0.29、0.38±0.22、0.48±0.25,两两比较:白藜芦醇组与代谢综合征组相比甘油三酯水平降低,结果具有统计学差异(P<0.05);其余各组间无统计学差异(P>0.05)。1.1.3血浆高密度脂蛋白代谢综合征组、白藜芦醇组及匹格列酮组的血浆高密度脂蛋白(mmol/l)分别为:0.44±0.06、0.41±0.05、0.46±0.08。各组间无统计学差异(P>0.05)。1.1.4血浆低密度脂蛋白代谢综合征组、白藜芦醇组及匹格列酮组的血浆低密度脂蛋白(mmol/l)分别为0.34±0.05、0.26±0.02、0.36±0.06。两两比较,白藜芦醇组低密度脂蛋白低于代谢综合征组,有统计学差异(P<0.05),白藜芦醇组低密度脂蛋白低于匹格列酮组,有统计学差异(P<0.05),代谢综合征与匹格列酮组相比无统计学差异(P>0.05)。1.1.5血浆极低密度脂蛋白代谢综合征组、白藜芦醇组及匹格列酮组的血浆极低密度脂蛋白(mmol/l)分别为0.41±0.14、0.17±0.10、0.22±0.12。两两比较:白藜芦醇组极低密度脂蛋白低于代谢综合征组,结果有统计学差异(P<0.05);匹格列酮组极低密度脂蛋白低于代谢综合征组,结果有统计学差异(P<0.05),白藜芦醇组和匹格列酮组比较无统计学差异(P>0.05)。1.2糖代谢相关指标1.2.1空腹血浆胰岛素代谢综合征组、白藜芦醇组和匹格列酮组的空腹血浆胰岛素(u IU/ml)分别为35.51±7.00、26.54±4.52、27.41±1.78,两两比较:白藜芦醇组、匹格列酮组均低于代谢综合征组空腹胰岛素水平,结果均有统计学差异(P<0.05),白藜芦醇组和匹格列酮组比较无统计学差异(P>0.05)。说明白藜芦醇和匹格列酮处理高脂喂养的大鼠,可以降低其胰岛素水平。1.2.2空腹血糖代谢综合征组、白藜芦醇组和匹格列酮组的空腹血糖(mmol/l)分别为4.68±0.45、4.82±0.31、4.74±0.48。两两比较均无统计学差异(P>0.05)。1.2.3 HOMA-IR代谢综合征组、白藜芦醇组和匹格列酮组的HOMA-IR分别为:7.38±1.60、5.68±0.98、5.76±0.54。两两比较,各组间两两比较无统计学差异(P>0.05)。但白藜芦醇组和匹格列酮组HOMA-IR已有下降趋势。2身体测量参数2.1大鼠体重代谢综合征组、白藜芦醇组和匹格列酮组的体重(g)分别为345.80±35.10、349.20±19.97、374.00±40.14。各组间无统计学差异(P值均>0.05)。2.2前列腺绝对重量代谢综合征组、白藜芦醇组和匹格列酮组的前列腺绝对重量(g)分别为0.54±0.07、0.37±0.06、0.35±0.06。白藜芦醇组、匹格列酮组前列腺绝对重量均低于代谢综合征组,均有统计学差异(P<0.05)。白藜芦醇组与匹格列酮组比较无统计学差异(P>0.05)。2.3内脏脂肪重量代谢综合征组、白藜芦醇组和匹格列酮组的内脏脂肪重量(g)分别为14.10±4.16、10.31±1.49、11.69±3.65。两两比较各组之间无统计学差异(P>0.05)。但白藜芦醇组和匹格列酮组较代谢综合征组相比,均有下降趋势。2.4前列腺指数代谢综合征组、白藜芦醇组和匹格列酮组的前列腺指数(mg/g)分别为:1.54±0.18、1.05±0.12、0.94±0.25。白藜芦醇组、匹格列酮组前列腺指数均低于代谢综合征组,均有统计学差异(P<0.05)。白藜芦醇组和匹格列酮组比较无统计学差异(P>0.05)。3组织学变化代谢综合征组动物前列腺腺腔内可见大量分泌物,腺上皮细胞层数增多,向腔内出芽明显,间质明显增多,且出现大量的脂肪细胞;白藜芦醇组及匹格列酮组,上述变化均在不同程度上得到改善,细胞层数减少,出芽现象减少尤其是上皮向腔内折叠现象,间质内脂肪细胞量减少。小结:由上可知,应用白藜芦醇治疗,可以改善高脂喂养导致的高胰岛素血症,从而改善前列腺增生程度,与匹格列酮相比无显著性差异。高胰岛素血症参与前列腺增生过程。第四部分白藜芦醇改善前列腺增生的机制研究在其他组织中,过氧化物酶增殖物激活受体PPARγ处于细胞内代谢平衡和分化的中心位置,已有研究证实PPARγ作为胰岛素下游通路中的一环确实参与前列腺增生过程。环氧合酶COX-2是PPARγ的下游基因,受PPARγ调控。两者协同调节细胞的增殖和凋亡。有研究表明PPARγ及COX-2均与氧化应激相关。氧化应激过程中重要高活性分子活性氧ROS可以作为第二信使影响各种细胞的信号转导、免疫功能、激素生物合成功能的活性产物。参与调控细胞的生长、细胞分裂、分化、迁移、凋亡及衰老等许多生理活动。NADPH氧化酶(NADPH oxidase)的非吞噬细胞氧化酶(non-phagocytic cell oxidas NOX)家族属于促氧化系统,超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase SOD)家族是抗氧化系统的重要酶系。两者共同作用维持内环境稳态的平衡。故而,本研究采用wistar大鼠高脂饮食诱导代谢综合征模型,取前列腺右腹侧叶,分析其中的关键分子信号PPARγ及其下游基因COX-2的变化,分析促氧化-抗氧化系统中NOX-2、NOX-4和SOD-1、SOD-2的变化。方法:适应性喂养1周,60%纯化型高脂饲料喂养Wistar大鼠9周建立代谢综合征模型。代谢综合征模型造模成功后,将代谢综合征模型动物随机分作三组:代谢综合征组、白藜芦醇处理组、匹格列酮处理组各5只,对照饲料喂养组(n=5)作为空白对照,分别给予60%纯化型高脂饲料、60%纯化型高脂饲料+白藜芦醇(resveratrol 50mg?kg-1,每天一次)、60%纯化型高脂饲料+匹格列酮(pioglitazone 20 mg?kg-1,每天一次)、与60%纯化型高脂饲料相匹配的对照饲料,共4周(第11-14周)。第14周末,取所有动物的前列腺右腹侧叶,Western blot法分析PPARγ、COX-2、NOX-2、NOX-4、SOD-1和SOD-2的变化。结果:以Western blot检测PPARγ、COX-2、NOX-2、NOX-4、SOD-1和SOD-2的IOD值与GAPDH的IOD值的比值表示这些分子表达的相对量。以正常对照组检测到的比值为标准计算各组相对于正常对照组的比值,以方差分析进行统计学处理。1 PPARγ空白对照组、代谢综合征组、白藜芦醇组和匹格列酮组分别为1.00、0.58、1.21、1.16。两两比较:代谢综合征组明显低于空白对照组,结果有统计学差异(P<0.05),白藜芦醇组和匹格列酮组均显著高于代谢综合征组,结果有显著性差异(P<0.05)。其他两组之间无统计学差异。2 COX-2空白对照组、代谢综合征组、白藜芦醇组和匹格列酮组分别为1.00、2.86、1.17、1.21。两两比较:代谢综合征组明显高于空白对照组,结果有统计学差异(P<0.05),白藜芦醇组和匹格列酮组均显著低于代谢综合征组,结果有显著性差异(P<0.05)。其他两组之间无统计学差异。3 NOX-2空白对照组、代谢综合征组、白藜芦醇组和匹格列酮组分别为1.00、1.95、1.21、1.01。两两比较:代谢综合征组明显高于空白对照组,结果有统计学差异(P<0.05),白藜芦醇组和匹格列酮组均显著低于代谢综合征组,结果有显著性差异(P<0.05)。其他两组之间无统计学差异。4 NOX-4空白对照组、代谢综合征组、白藜芦醇组和匹格列酮组分别为1.00、3.18、1.13、1.08。两两比较:代谢综合征组明显高于空白对照组,结果有统计学差异(P<0.05),白藜芦醇组和匹格列酮组均显著低于代谢综合征组,结果有显著性差异(P<0.05)。其他两组之间无统计学差异。5 SOD-1空白对照组、代谢综合征组、白藜芦醇组和匹格列酮组分别为1.00、0.61、1.01、1.04。两两比较:代谢综合征组明显低于空白对照组,结果有统计学差异(P<0.05),白藜芦醇组和匹格列酮组均显著高于代谢综合征组,结果有显著性差异(P<0.05)。其他两组之间无统计学差异。6 SOD-2空白对照组、代谢综合征组、白藜芦醇组和匹格列酮组分别为1.00、0.62、1.22、1.23。两两比较:代谢综合征组明显低于空白对照组,结果有统计学差异(P<0.05),白藜芦醇组和匹格列酮组均显著高于代谢综合征组,结果有显著性差异(P<0.05)。其他两组之间无统计学差异。小结:高脂饮食喂养诱导前列腺组织中COX-2、NOX-2、NOX-4表达升高,PPARγ、SOD-1、SOD-2表达降低,导致活性氧的产生和蓄积,诱导前列腺细胞增殖、分化;应用白藜芦醇和匹格列酮处理均能使前列腺组织中COX-2、NOX-2、NOX-4表达降低,使PPARγ、SOD-1、SOD-2表达增加。白藜芦醇和匹格列酮可以通过调节PPARγ和COX-2表达的变化和改变氧化-抗氧化平衡,调节活性氧的产生和蓄积,从而抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡,改善前列腺增生。提示高脂饮食通过该路径诱发前列腺增生,白藜芦醇通过该路径改善前列腺增生,起到与匹格列酮相同的作用。结论1研究表明,通过高脂喂养大鼠可以模拟代谢综合征的核心要素疾病,导致大鼠出现胰岛素抵抗/高胰岛素血症和内脏性肥胖。2高脂喂养的大鼠,其前列腺绝对重量、前列腺指数均明显高于对照组,组织学检查提示出现前列腺增生特征表现,说明代谢综合征可以诱导出现前列腺增生。3通过在高脂喂养的同时,添加白藜芦醇和匹格列酮处理,可以逆转高胰岛素血症,可以减轻高脂喂养大鼠的前列腺绝对重量和前列腺指数,组织学检查亦发现前列腺增生明显减轻。4白藜芦醇治疗前列腺增生的机制可能是通过增加PPARγ表达,降低COX-2的表达,调节细胞的增殖和凋亡过程,促进细胞凋亡,从而改善前列腺增生。5白藜芦醇和匹格列酮还可以调节氧化-抗氧化平衡中的重要酶,使NOX-2、NOX-4表达降低,SOD-1、SOD-2表达增加,通过ROS第二信使作用,调节前列腺细胞增殖和凋亡,达到抑制前列腺增生的目的。白藜芦醇无毒害,为天然植物如葡萄及其加工产品中所含有,能起到和匹格列酮类似的治疗高胰岛素血症和前列腺增生的作用。本研究为临床处理代谢综合征导致的前列腺增生提供了新的思路。可以通过增加该种植物或其加工产品的摄入,可能起到预防、治疗代谢综合征导致前列腺增生的作用。