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研究背景与目的乳腺癌发病率居女性恶性肿瘤首位,占全身各种恶性肿瘤的7%-10%,是危害妇女健康的主要肿瘤。全世界每年约有120～140万妇女发生乳腺癌,约有50万妇女死于该病。北美、北欧是乳腺癌的高发地区,其发病率约为亚、非、拉美地区的4倍。我国虽是乳腺癌的低发地区,但其发病率逐年上升,每年递增3%左右,尤其沪、京、津及沿海地区是我国乳腺癌的高发地区,以上海最高,1972年上海的乳腺癌标化发病率为17／10万,1995年则为38／10万,为女性恶性肿瘤发病率中的第1位。如何有效地预防和治疗乳腺癌成为人们关注的焦点。随着现代分子生物学的发展,研究者们逐渐认识到在真核细胞信号传导过程中,通路蛋白的磷酸化和去磷酸化修饰是信号通路调控的重要方式,两者之间的平衡在细胞正常信号转导及肿瘤发生、发展过程中起着非常重要的作用。p21-activated kinase (PAKs)即p21小GTP酶活化激酶,是一组丝氨酸／苏氨酸蛋白质磷酸化激酶家族。分子量为21 kD、Rho家族的小GTP酶即Cdc42和Rac1是PAKs的上游分子(即PAKs为Cdc42和Rac1的效应分子)。在分子结构上,PAK N-末端为激酶的调节区,C-末端为激酶的底物结合区,具有激酶活性。PAK4-3构成第一组PAK,分子量为62-64 kD,其激活需要Cdc42和Rac。PAK4-6构成第二组PAK,分子量为65-68 Kd。除调节胚胎发育、正常的细胞生长,分化和凋亡外,PAK家族成员还在人类疾病中起重要作用。PAK4是PAK家族中与人类肿瘤关系密切的成员,其在细胞骨架修复、延长正常细胞寿命和正向调节一些正常生理代谢等方面都起重要作用。PAK4为第二组PAK中最先别报道者,能在大多被检组织中检测到,但在乳腺癌和卵巢癌细胞中PAK4的表达远高于其它肿瘤细胞,而且PAK4表达与乳腺癌和卵巢癌细胞的增殖和侵袭转移呈正相关。但PAK4在乳腺癌的发生发展、演化和转移中的作用机制尚未明确,因此本课题在系统地检测PAK4在乳腺癌旁正常组织—乳腺囊性增生病—乳房纤维腺瘤—原发性乳腺癌组织—乳腺癌转移瘤组织中的表达差异和分布特点基础上,同时构建PAK4真核表达载体和AK4 shRNA真核表达载体,转染乳腺癌MDA-MB-231细胞,观察上调和下调乳腺癌细胞PAK4表达后对乳腺癌细胞增殖、凋亡,细胞粘附、运动、侵袭和致瘤等生物学活性的影响,以期深入了解PAK4在乳腺癌细胞演化和转移中的作用和机制,并探讨PAK4作为乳腺癌转移标志和作为潜在治疗靶点的可能性。研究方法PAK4在良性及恶性乳腺病变中的表达检测及意义用免疫组织化学S-P法检测PAK4在乳腺癌癌旁正常组织、乳腺囊性增生病、乳房纤维腺瘤、乳腺癌和乳腺癌转移瘤组织中的表达,并分析PAK4表达与乳腺癌临床病理特征的关系。二、PAK4对乳腺癌细胞表型的影响利用基因重组技术分别构建PAK4真核表达载体和PAK4 shRNA真核表达载体,并以乳腺癌细胞MDA-MB-231作为模型,转染重组载体后观测对乳腺癌MDA-MB-231细胞生物学活性的影响。1、PAK4真核表达重组质粒的构建按照GenBank上公布的PAK4 mRNA序列,在其编码区(CDS)设计两端带有EcoRI和BamHⅠ酶切位点的引物,利用PCR扩增PAK4 CDS区。EcoRI和BamHⅠ双酶切纯化的PCR产物和真核表达载体pEGFP/C1, T4连接酶连接酶切纯化后的PCR产物和酶切纯化后的pEGFP/C1,转化到乳腺杆菌DH5a中。挑单菌落培养扩增,提取重组质粒后行酶切鉴定,选择插入片段正确的克隆测序鉴定。2、PAK4 shRNA重组载体的构建根据siRNA设计的原则,在PAK4 mRNACDS设计3对siRNA核苷酸序列,并设计一对非相关核苷酸序列作为对照,经GenBank在线BLAST确定确定与其它人类基因无高度同源后,分布在所设计的siRNA两端分别加上带有BamHⅠ和EcoRI酶切位点的shRNAs单链送公司合成。复性合成双链,按常规操作把shRNA序列克隆到pRNAT-U6.1/Neo载体中,重组质粒酶切和测序鉴定。3、转染细胞和建立稳定转染细胞克隆采用Invintrogen公司的Lipofectamine2000TM脂质体进行细胞转染。细胞转染48h后用分别用G418筛选阳性细胞克隆,挑取单克隆细胞扩增培养。4、PAK4表达调控效应检测RT-PCR和免疫印迹、免疫细胞化学与激光共聚焦显微镜检测PAK4 mRNA和蛋白质水平表达改变。5、细胞增殖与凋亡MTT法检测PAK4对乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖的影响；采用DNA片段法检测PAK4对5-Fu诱导的细胞凋亡的影响。6、细胞基质粘附实验参照文献的方法研究PAK4对乳腺癌细胞MDA-MB-231粘附的影响。7、单层细胞划痕愈伤实验分析单层细胞划痕愈伤实验分析PAK4对乳腺癌细胞移行的影响。8、侵袭实验观察改变PAK4表达对乳腺癌细胞侵袭能力的影响。9、软琼脂糖集落形成实验观察RNAi沉默PAK4表达对MDA-MB-231细胞锚着独立性生长的影响。10.裸鼠成瘤实验观察PAK4表达对MDA-MB-231细胞裸鼠成瘤的影响,包括成瘤瘤体大小、侵袭转移部位差异。三、对PAK4在乳腺癌恶性程度诊断及预后中的作用进行初步研究选择乳腺癌中的一个特殊部分即三阴乳腺癌(TNBC)进行研究,探讨PAK4在TNBC的发病机制中是否起了特殊作用；并对乳腺癌组织中PAK4表达不同的患者复发、转移的情况进行对照,研究结果一、PAK4在良、恶性乳腺病变中的表达及意义1.乳腺癌、乳房纤维腺瘤等组织的PAK4阳性产物主要位于胞浆,尤以核周明显,细胞基质未见明显染色。2.正常乳腺组织(或乳腺囊性增生病)、乳房纤维腺瘤、乳腺癌和乳腺癌转移瘤组织中的PAK4表达总体阳性率依次升高；提示PAK4与乳腺癌演进和转移密切相关。3.在非浸润性癌、早期浸润癌、浸润癌三种不同病理分期的乳腺癌组织中PAK4的表达呈明显依次升高趋势,各组两两比较均有显著性差异。二、PAK4对乳腺癌细胞生物学活性的影响1.成功构建了PAK4真核表达载体pEGFP-C1/PAK4,并经酶切和测序鉴定证实；成功构建了PAK4 shRNA真核表达载体pRNA6.1/Neo-shRNA1、pRNA6.1/Neo-shRNA2、pRNA6.1/Neo-shRNA3和PAK4 shRNA非相关序列载体pRNA6.1/Neo-shRNA-N,并经酶切和测序鉴定证实插入序列与设计的完全一致。2.重组载体转染MDA-MB-231细胞,经G418筛选得到稳定细胞克隆株。3.与对照pRNA6.1/Neo-shRNA-N和pRNA6.1/Neo相比,pRNA6.1/Neo-shRNA1、pRNA6.1/Neo-shRNA2和pRNA6.1/Neo-shRNA3可以有效下调MDA-MB-231细胞内源性PAK4 mRNA和蛋白的表达；pEGFP-C1/PAK4在MDA-MB-231细胞浆中稳定表达,提示MDA-MB-231PAK4建株成功。4.PAK4高表达可以促进大肠癌MDA-MB-231细胞增殖,下调PAK4表达则可以抑制大肠癌细胞的增殖；PAK4高表达可以增强大肠癌细胞的异质粘附,下调PAK4表达则抑制MDA-MB-231细胞的异质粘附；PAK4增强大肠癌细胞的非锚定依赖式生长,下调PAK4表达则抑制大肠癌细胞的集落形成能力；PAK4增强大肠癌细胞移行能力,下调PAK4表达则明显抑制大肠癌细胞的移行能力；PAK4增强大肠癌细胞对基质的侵袭能力,下调PAK4表达则可以减弱大肠癌细胞的侵袭力。5.PAK4可以抗5-Fu诱导的大肠癌凋亡,抑制PAK4表达可以增强大肠癌细胞对5-Fu的敏感性。PAK4高表达可以促进大肠癌细胞分泌基质金属蛋白酶2,提示PAK4增加大肠癌细胞的转移潜能可能与增强基质金属蛋白酶2的活性有关。6.血管内皮生长因子可以诱导PAK4在大肠癌细胞中的表达,提示VEGF可能通过PAK4影响大肠癌细胞的侵袭和转移；裸鼠成瘤实验显示,抑制PAK4基因的表达,可以负向调节大肠癌细胞的增殖和转移。三、PAK4在乳腺癌诊断中的作用的初步研究对PAK4在乳腺癌恶性程度诊断及预后中的作用进行的研究显示：1.三阴乳腺癌患者PAK4的表达率及表达量均明显高于非三阴乳腺癌患者。2.三阴乳腺癌患者中PAK4表达高者复发及转移率高于表达低者。3.PAK4有可能是三阴乳腺癌发病机制中的重要因素之一。结论1、PAK4在不同的乳腺病变中表达有显著性差异。2、上下调PAK4表达可以明显改变乳腺癌细胞MDA-MB-231的多种生物学活性。3、PAK4有可能是三阴乳腺癌发病机制中的重要因素之一