一、研究背景新生儿较年长儿易于出血，约50%新生儿出生时有出血的临床表现，其原因包括血小板数量和（或质量）异常、血管壁异常，以及凝血系统异常。后者又包括遗传性及继发性凝血因子缺乏，是引起新生儿出血的重要原因之一，严重者因颅内出血致死或遗留中枢神经系统后遗症。由于新生儿时期出血性疾病的病因复杂，临床表现多样且无特异性，约1/3遗传性凝血因子缺乏症患儿缺乏明确的家族史，因此，早期诊断不易。凝血因子水平检测是诊断及鉴别诊断的重要依据。与年长儿及成人比较，新生儿期凝血因子水平有一定的特点。首先，新生儿处于相对低凝状态：在胎儿第10~11周凝血因子开始合成，在第19~27周胎血中已能检出全部凝血因子，其水平随胎龄增加而增加，但是，直至出生时仍低于正常成人；其次，生后凝血系统发育迅速，凝血因子水平处于动态变化过程之中，且各凝血因子水平的发育不尽一致。基于上述原因，需要建立不同时期的、符合统计学要求的凝血因子水平参考值范围，并探讨影响凝血因子水平的因素，以期为出血性疾病的诊断和鉴别诊断提供可靠的依据。脐带血取材方便，且在生后即可获得。但脐带血凝血因子水平如何？与生后凝血因子水平的动态变化有无关系？能否预测凝血因子缺乏所致的出血性疾病？这是本研究期望回答的问题。复习文献，目前有关脐带血凝血因子水平的研究报道不多，由于各研究的样本量、研究对象的入选条件、检测方法、统计学方法，乃至研究对象的种族等不同，研究结果也不尽一致。有关脐带血凝血因子活性水平影响因素的研究则更少，且选取的影响因素较少，尚不能全面、系统地反映孕母围产期情况及新生儿出生时的生理、病理因素对脐带血凝血因子活性水平的影响。二、研究目的通过检测新生儿脐带血中凝血因子水平活性水平，建立正常新生儿脐带血凝血因子活性水平的参考范围，并初步探讨孕母妊娠期情况及新生儿出生时的生理及病理状况对脐带血凝血因子活性水平的影响。三、研究内容（一）检测脐带血八种凝血因子的活性水平，包括凝血因子II（Factor II，FII）、FV、FVII、FVIII、FIX、FX、FXI和FXII。（二）建立正常新生儿脐带血凝血因子活性水平的参考范围。（三）分析孕母及胎儿/新生儿出生时的生理及病理状况对对脐带血凝血因子活性水平的影响。四、研究方法（一）调查问卷设计及使用本研究问卷主要依据医学统计学中问卷设计的原则、内容、设问方式及注意事项，并结合本研究的目的及其背景而进行设计。分为新生儿基本信息、出生情况、母亲孕期情况和家庭成员健康情况等四部分共51个问题。使用问卷前进行了小规模的预实验，针对受试者不易回答的问题进行修改，确保调查问卷的适用性和可信性。通过现场调查和查阅病历结合的方式完成调查问卷的填写。（二）研究对象2011年11月至2012年1月在广州市妇女儿童医疗中心产科出生的新生儿及其母亲。（三）标本的采集、处理及检测1.标本采集及处理新生儿脐带结扎后即刻采取脐静脉血3.6ml，平分入2管真空采血管（1:9枸橼酸钠抗凝）内，立即上下颠倒混匀，30min内进行离心，吸取上层血浆置-80℃保存备用。2.建立标准曲线以CA-1500全自动凝血分析仪及其配套的通用凝血定标血浆分别制定FII、FV、FVII、FVIII、FIX、FX、FXI和FXII等八种凝血因子活性水平的标准曲线。3.实验质量控制每次检测脐带血凝血因子活性水平之前，先行实验质控。以CA-1500全自动凝血分析仪检测与仪器配套的正常质控血浆（即凝血质控血浆N）和患者质控血浆（即凝血质控血浆P）的凝血因子活性水平，如其结果在试剂说明书提供的参考范围内，则符合实验质控要求。4.脐带血凝血因子活性的检测检测前将保存于-80℃的冰冻脐带血血浆置37℃水浴箱内快速解冻，再依照CA-1500全自动凝血分析仪的说明书步骤，检测脐带血血浆中FII、FV、FVII、FVIII、FIX、FX、FXI和FXII等八种凝血因子的活性水平。（四）数据录入每份脐带血标本以对应标本编号及对应孕母的住院号为识别标记。调查问卷中，以开放式提问的填写信息（如孕母的姓名、住址和联系方式等）以文本形式录入Excel文件；以封闭式提问的选择信息（如出生情况、分娩方式和出生后Apgar评分等）则以对应答案的编码数字形式录入Excel文件；每份脐带血八种凝血因子活性水平的检测结果录入Excel文件中，置于相应的孕母及其新生儿问卷调查信息之后。录入调查问卷的信息和检测数据需经2人分别核实2次，以确保录入的数据准确、完整和真实。（五）正常新生儿脐带血凝血因子水平参考范围的确定1.研究例数的确定根据美国临床实验室标准化协会(Clinical and Libratorystandards Institute，CLSI)C28-A3文件[7]要求，建立正常参考范围所需研究例数至少120例。本研究首先确定正常新生儿的入选条件，再从上述所有受检对象中筛选出符合正常新生儿入选条件者，统计分析其脐带血凝血因子水平的检测结果，确定正常新生儿脐带血凝血因子水平的参考范围。2．正常新生儿的入选条件①孕母年龄<35周岁；②孕母无血液系统疾病病史及其家族史；③孕母无妊娠并发症，且产前未使用过任何药物（包括妊娠并发症相关药物和维生素K制剂等）；④新生儿为单胎、顺产娩出；⑤37周≤新生儿胎龄<42周；⑥2500g≤出生体重≤4000g，均为适于胎龄儿；⑦新生儿无宫内窒息史，出生后1分钟Apgar评分>7分，且出生后5分钟Apgar评分>7分；⑧新生儿出院前体温、进食、睡眠正常，无出血倾向。3．统计分析及正常新生儿脐带血凝血因子水平参考范围的确定运用SPSS17.0统计软件对正常新生儿脐带血各种凝血因子活性水平检测结果进行正态性检验。符合正态分布的数据，确定其95%参考范围双侧采用“x-1.96s~x+1.96s”，单侧上限“x+1.96s”，单侧下限“x-1.96s”；99%参考范围双侧为“x-2.58s~x+2.58s”，单侧上限为“x+2.58s”，单侧下限为“x-2.58s”。不符合正态分布的数据用百分位数表示，确定其95%参考范围双侧为P2.5~P97.5，单侧上限为P95，单侧下限为P5；99%参考范围双侧为P0.5~P99.5，单侧上限为P99，单侧下限为P1。（六）影响脐带血凝血因子活性水平的因素分析1.影响因素的选择（1）孕母妊娠期因素①孕母年龄；②围产期感染；③妊娠期病原学检测；④妊娠合并糖尿病（Gestational diabetes mellitus，GDM）；⑤妊娠合并妇科疾病；⑥妊娠高血压综合征。（2）胎儿/新生儿因素①胎龄；②性别；③出生体重；④分娩方式；⑤多胎妊娠；⑥宫内缺氧；⑦其他内、外科疾病；⑧出血性疾病家族史。2．脐带血凝血因子活性水平的影响因素分析运用SPSS17.0统计软件对各组影响因素中脐带血凝血因子活性水平检测结果进行正态性及方差齐性检验。以α=0.05为检验水准，对于符合正态性分布及方差齐的数据采用t检验方法，对于不符合正态性分布及方差不齐的数据采用Mann-Whitney U检验方法，以α=0.05为检验水准，比较各影响因素组与正常新生儿组的脐带血血浆中FII、FV、FVII、FVIII、FIX、FX、FXI和FXII等八种凝血因子活性水平的差异，分析孕母妊娠期及新生儿出生时的生理及病理状况对对脐带血凝血因子活性水平的影响。五、研究结果（一）调查问卷的使用情况本研究共收集新生儿脐带血291份，其所对应的孕（产）妇全部接受了问卷调查，问卷回收率100%。通过现场调查与查阅病历，取得调查问卷中所有问题的信息。（二）脐带血采集结果本研究共收集新生儿脐带血291份，其中正常新生儿脐带血136份，剖宫分娩组31份，宫内缺氧组30份，双胎妊娠组25份，GDM组13份，早产儿组12份，妊娠合并妇科疾病组10份，巨大儿组10份，高龄初产组8份，围产期感染组8份，孕母或新生儿同时存在两种或两种以上因素异常者7份，新生儿于出生后1小时内因全身严重变形抢救无效死亡1份。（三）标准曲线及实验质量控制结果建立了八种凝血因子活性水平相应的标准曲线（见图2）。本研究所采集的291份脐带血标本分5次进行检测，共进行了5次实验质量控制，每次质控结果均在试剂说明书提供的参考范围以内，符合实验质量控制的要求。（四）脐带血血浆凝血因子活性水平的参考范围检测FII、FV、FVII、FVIII、FIX、FX、FXI及FXII等八种凝血因子活性水平，其95%参考范围（双侧）分别为27.04~49.02、53.30~116.40、27.80~56.70、19.16~113.06、19.85~35.65、24.20~48.00、24.40~42.20及9.20~54.60；99%参考范围（双侧）分别为23.56~52.50、53.30~116.40、27.80~56.70、4.31~127.91、17.35~38.15、24.20~48.00、24.40~42.20及9.20~54.60。（五）脐带血凝血因子水平的影响因素1．孕母妊娠期情况对脐带血凝血因子水平的影响高龄初产组与适龄初产组比较，前者FII和FIX的活性水平均较高（p=0.009、0.028）；围产期感染组与围产期非感染组比较，前者的FXI较低（p=0.042）；GDM组与非GDM组比较，两组各凝血因子水平均无统计学意义（p>0.05）；妊娠合并妇科疾病组与妊娠无合并妇科疾病组比较，前者的FVIII较低（p=0.043），FII、VII、和FX较高（p=0.032、0.024、0.022）。本研究所收集样本中无符合病原学检查阳性组、妊娠高血压综合征组的入选条件者。2．新生儿生理、病理状况对脐带血凝血因子活性水平的影响正常男、女新生儿脐带血凝血因子水平的差异缺乏统计学意义（p>0.05）；早产儿组与足月儿组比较，前者FII、FV、FIX和FXI的活性水平较低（p=0.031、0.037、0.000、0.002）；巨大儿组与出生体重正常组比较，前者的FII和FVII较高（p=0.043、0.043）；剖宫分娩组与自然阴道分娩组比较，前者的FVIII较低（p=0.004）；双胎妊娠组与单胎妊娠组比较，前者的FVIII、FIX和FXI较低（p=0.002、0.000、0.028）；宫内缺氧组与无宫内缺氧组比较，前者的FII和FVIII较低（p=0.032、0.012）。六、结论1．正常新生儿脐带血FII、FV、FVII、FVIII、FIX、FX、FXI及FXII等八种凝血因子活性水平的95%参考范围（双侧）分别为27.04~49.02、53.30~116.40、27.80~56.70、19.16~113.06、19.85~35.65、24.20~48.00、24.40~42.20及9.20~54.60；99%参考范围（双侧）分别为23.56~52.50、53.30~116.40、27.80~56.70、4.31~127.91、17.35~38.15、24.20~48.00、24.40~42.20及9.20~54.60。其中FVIII活性水平低于国外文献的报道，但与国内楼金吐等[1]报道结果一致；FXII活性水平也低于国外文献报道的脐带血水平[2,3,4]，亦与国内文献[1,5,6]报道的健康足月儿脐带血水平接近。2．本研究显示，除孕母患GDM及新生儿性别外，其余因素对脐带血部分凝血因子活性水平存在一定影响：高龄孕妇脐带血FII和FIX活性水平均较高；围产期感染者FXI较低；妊娠期合并子宫肌瘤者FVIII较低，FII、VII、和FX较高；早产儿FII、FV、FIX和FXI较低；出生体重>4.00kg者FII和FVII较高；宫内窘迫伴羊水II~III度浑浊者FII和FVIII较低；剖宫产分娩者FVIII较低；双胎妊娠足月新生儿FVIII、FIX和FXI较低。3.上述研究结果与国内外研究报道不尽一致，分析可能与各研究中研究对象的入选标准、例数、检测方法、凝血因子自身的特点、种族等等因素有关。本研究在建立脐带血凝血因子水平参考范围时，共采集脐带血136例，明显多于目前国内外文献报道的样本量，符合美国临床实验室标准化协会（Clinical andLibratory standards Institute，CLSI）C28-A3文件[7]要求。在分析影响脐带血凝血因子活性水平的因素时，所考虑的影响因素也较目前文献报道全面。期望本研究结果能较为客观地反映我国新生儿脐带血凝血因子活性水平。