前言 近年来，生物界发生的生殖异变、人类生殖系统肿瘤发病率的升高趋势引起人们的广泛关注。许多研究提示这些现象与环境污染有关。一些化学污染物在生物体内具有激素样或抗激素样作用，从而干扰机体的内分泌平衡。因此，这类环境污染物又称为“环境类激素污染物”(Environmental Hormone Pollutions)或“内分泌干扰物质”(Endocrine Disruptors)。在1997年WHO报告的76种具有环境类激素作用的化学物质中，二噁英、多氯联苯、DDT等最具代表性。在自然界存在的200多种二噁英同类物中，以2，3，7，8位-氯代氢的二噁英(2，3，7，8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin TCDD)毒性最大，是二噁英毒性研究中最具代表性的物质。TCDD的主要污染来源是垃圾焚烧、汽车尾气排放、除草剂生产及纸浆氯化漂白等生产过程，其主要通过食物、水、土壤、尘埃、空气进入人体，具有致癌及环境类激素作用。近年来，有关TCDD的生殖毒性和其它内分泌干扰作用已成为人类健康研究的热点。 目前关于TCDD的生殖毒性研究多集中在雄性生殖系统。国外动物实验报道，孕期和哺乳期TCDD处理可对雄性生殖系统发育产生一定生殖毒性，包括导致尿道下裂，前列腺、附睾重量下降，日精子产量下降等。但由于TCDD的剂量、处理时机及实验物种间的差异，许多实验结果尚有争议。目前关于孕期TCDD处理是否影响子鼠血清睾酮水平的统计学意义至今仍未建立，因此这是本实验的目的之一。 EGF是一种有力的有丝分裂原，通过与其受体EGFR的结合，促进细胞增殖，调节组织分化和器官发生。近年研究报道，EGF对雄性生殖系统的发育和功能有重要的调节作用。TCDD的激素样干扰作用是否影响了颌下腺和睾丸组织内EGF，EGFR的表达及其意义如何？目前有关研究报道尚少，因此这也是本实验需要探讨的问题。 本实验在个体器官发育的关键时期（孕期第15天）给予孕鼠TCDD处理一次，采用放射免疫测定方法和免疫组织化学方法，测定不同发育阶段的雄性子鼠血清寒酮水平和观察TCDD处理对睾丸AR上GF表达，颌下腺EGF上CFR表达的影响，以期揭示孕期TCDD暴露是否对子代有确切的生殖毒性作用，及对EGF－EGFR途径有何影响，希望为干预措施的制定提供新的实验依据和思路。 实验材料 1．实验动物 4月龄健康SPragUe－Dawle大鼠，由中国医科大学实验动物部提供。 2．主要试剂 TCDD（2，3，7，8－tetrachlorodibem。－p－dloxln）； 市售精制玉米油； 寒酮放免分析试剂盒； SABC免疫组化试剂盒； 兔抗大鼠表皮生长因子问GF）和表皮生长因子受体瞩GFR）的多克隆抗体； 小鼠抗大鼠雄激素受体（AR）的单克隆抗体。 3．主要仪器 高速冷冻离心机（微量入林玛计数仪；图象分析仪；石蜡切片机； ·2· 实验方法 1．动物模型建立 SD大鼠，雌雄随机交配。次日晨雌鼠阴道发现阴道栓为妊娠第0天。于孕15日晨灌胃一次。实验组：sugTCDD八g，灌胃量Zndkg，溶剂为玉米油／丙酮”5／5，v／V人对照组以溶剂灌胃。 分娩不足8只子鼠的孕鼠被淘汰。于PNDI同组调整每窝8只子鼠，雌雄配比为4：4。PND21天断奶，淘汰雌鼠。分别于PNDZI，PND32，PNm9，PND63每窝取一只雄子鼠进行取材。 2．标本制备 断头取血，血液低温离心，收集血清，－70℃保存，用于放免测定。 雄子鼠腹腔麻醉，经左心室4％多聚甲醛灌流固定，取颌下腺和左侧睾丸，寒丸矢状正中剖开，于同样固定液后固定，常规脱水、透明、石蜡包埋。5卜m厚切片，用于免疫组织化学染色。睾丸切面向下包埋，5卜m切片，隔 6张切片取一张做免疫组化。 3．放射免疫分析 待测血清平衡至室温；加样：依次加人‘内标记的睾酮、抗睾酮抗体；37℃温育二小时；4℃放置1小时为人分离剂后离心；吸弃上清；测各管沉淀放射性计数率。 4．免疫组织化学 石蜡切片标本，脱蜡水化；3％的H尸DRT（室温）6分钟；正常羊血清，RT40分钟；加一抗RT孵育1小时，湿盒4℃过夜。次日晨加二抗，RTho分钟；加三抗KP复合物人RT60分钟；期间均用0．01MPBS洗5’X4次；DAB显色7—15分钟，用蒸馏水终止反应。苏木素复染。常规脱水，透明，封片。对照实验：用PBS代替第一抗体染色结果为阴性。 5．免疫反应产物的定量分析 ·3· 用CoolsPaPfa瞩OPER日本）图象分析仪分析对照组和TCDD实验组大鼠睾丸AR上GR免疫产物的相对含量；颌下腺EGF和EGFR免疫产物的相对含量。 6．统计学处理 采用SAS统计软件分析数据。全部实验数据以均数上标准差k加）表示，两均数间比较用t检验。 实验结果 二．TCDD对大鼠体重及睾丸重量的影响 TCDD实验组大鼠的体重增长和睾丸重量均低于正常对照组。但只有在PND21有统计学意义h＜0．01人 2．?