目的:1第一部分临床研究:观察肝细胞肝癌（Hepatocellulaer carcinoma,HCC）患者接受肝动脉化疗栓塞术（Transarterial Chemoembolization,TACE）治疗前后高尔基体跨膜糖蛋白73（Golgi Protein 73,GP73）表达水平的变化趋势、缺氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α）表达水平的变化趋势以及缺氧诱导因子-2α（hypoxia inducible factor-2α,HIF-2α）表达水平的变化趋势。不同TACE治疗效果分组的HCC患者之间GP73、HIF-1α及HIF-2α的表达水平分别是否存在差异。GP73在TACE治疗前后发生的变化分别与HIF-1α以及HIF-2α在TACE治疗前后发生的变化之间是否有联系。为课题假设以及下一步体外细胞实验的开展找到临床证据。2第二部分体外细胞实验:观察不同缺氧程度以及不同缺氧培养时间下人肝癌细胞GP73、HIF-1α以及HIF-2α的表达水平是否发生变化。GP73发生的变化分别与HIF-1α以及HIF-2α发生的变化之间是否有联系。进一步在细胞水平为课题假设找到证据。并为下一步体外细胞调控实验确定合适的缺氧浓度及缺氧时间的肝癌细胞培养条件。3第三部分体外细胞实验:通过对HIF-1α与GP73的调控,探究缺氧微环境下HIF1-α调控GP73导致Hep G2细胞发生细胞侵袭和转移、上皮间充质转化（Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT）等恶性生物学行为的机制。方法:1第一部分,GP73、HIF-1α与HIF-2α在肝细胞肝癌经TACE治疗前后变化趋势与TACE治疗效果的相关性研究方法:2020年09月至2021年05月间,收集151例新疆医科大学第一附属医院介入放射科收治的经TACE治疗的HCC患者自外周静脉所采集的静脉血液标本,标本采集时间点共6个,包括TACE术前1天,术后1、3、5、7、30天。最终纳入51例各时间点外周静脉血标本完整以及临床随访资料完整的患者为研究对象。同时收集2020年09月至2021年05月于新疆医科大学第一附属医院进行健康体检的50例健康人的外周静脉血标本。使用酶联免疫吸附测定法（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测外周静脉血标本血浆中GP73、HIF-1α及HIF-2α的表达水平。分析肝癌患者术前与正常人GP73、HIF-1α及HIF-2α表达水平的差异。分析不同TACE治疗效果及不同时间点GP73、HIF-1α及HIF-2α表达水平的变化趋势。分析51例肝癌患者不同时间GP73、HIF-1α、HIF-2α表达水平的变化趋势之间的关系。分析不同TACE治疗效果之间术前1天与术后30天GP73、AFP表达水平变化量及变化率的差异。分析GP73的变化是否为TACE治疗效果的影响因素。分析肿瘤大小、肿瘤个数、肝功能Child-Pugh分级及巴塞罗那分期（Barcelona Clinic Liver Cancer,BCLC）分期与术前GP73表达水平的相关性。2第二部分,不同缺氧程度及不同缺氧培养时间下肝癌细胞GP73、HIF-1α及HIF-2α表达水平的相关性研究方法:预实验首先通过检测不同侵袭转移能力的人肝癌细胞系中的GP73的RNA及蛋白的表达量,筛选出最终进行实验的细胞系。其中MHCC97-L细胞系是转移能力较低的人肝癌细胞系,MHCC97-H细胞系是转移能力较高的人肝癌细胞系,Hep G2细胞系是转移能力介于前面两种细胞系之间的人肝癌细胞系。然后正式实验中利用筛选出的细胞系建立TACE缺氧肝癌细胞模型,分别在不同缺氧程度（常氧组、10%O2组、5%O2组、2%O2组、1%O2组、0%O2组）以及不同缺氧培养时间下（常氧组、缺氧6h组、缺氧14h组、缺氧24h组、缺氧48h组、缺氧72h组、缺氧120h组）培养该肝癌细胞系,模拟TACE治疗中不同栓塞程度下肝癌细胞所处的缺氧环境。在细胞水平分别观察不同缺氧程度以及不同缺氧培养时间下肝癌细胞的细胞形态变化、细胞增殖情况、ELISA法检测细胞培养上清液中GP73、HIF-1α以及HIF-2α的表达水平是否存在差异。Western blot法检测检测细胞中GP73、HIF-1α以及HIF-2α的表达水平是否存在差异。不同分组中GP73表达水平的差异分别与HIF-1α以及HIF-2α发生的差异变化是否有联系。3第三部分,HIF-1α在缺氧微环境中影响GP73表达促进Hep G2肝癌细胞侵袭转移的机制研究方法:在本部分研究中,通过设定不同的实验干预分组,共设置7个分组,包括:Control组、缺氧空白对照组、缺氧+慢病毒空载对照组、缺氧+沉默GP73组、缺氧+2-甲氧基雌二醇（2-Methoxyestradiol,2ME2）对照组、缺氧+2ME2+慢病毒空载对照组与缺氧+2ME2+过表达GP73组,并在第二部分中确定的缺氧程度以及缺氧时间培养条件下培养Hep G2细胞,各分组细胞实验与测定的项目及指标包括CCK-8法测定增殖活力、流式细胞仪测定凋亡情况、Transwell小室测定迁移、侵袭的差异,ELISA法检测细胞培养上清液中GP73、乙型转化生长因子（Transforming Growth Factor Beta,TGF-β）的表达水平各组是否存在差异。Western blot法检测检测细胞中GP73、HIF-1α、Smad2、p-Smad2、Smad3、p-Smad3、E-cadherin及Vimentin的表达水平各组是否存在差异。从而探讨HIF1-α调控GP73在缺氧微环境下促进肝癌细胞发生EMT导致肝癌TACE预后不良的机制。结果:1第一部分:51例肝癌患者术前GP73、HIF-1α、HIF-2α表达水平与50例正常人之间存在明显统计学差异（P＜0.001）,且正常人3个指标表达水平显著低于肝癌患者。经广义估计方程分析,TACE治疗效果差组与TACE治疗效果好组进行比较,治疗效果不同的分组中GP73的表达是不相同的,且之间的不同经统计学分析后是有意义的（P＜0.05）。所测定的各时点的GP73表达也不同,且经过统计学分析后有意义（P＜0.001）,TACE治疗与时间的交互效应有统计学差异（P＜0.05）。总体上,TACE治疗效果好组与TACE治疗效果差组术前1天、术后1、3、5、7、30天GP73表达水平都具有统计学差异（P＜0.001）。TACE治疗效果好组与TACE治疗效果差组术后5天GP73表达水平存在着统计学差异（校正均值0.09,95%CI 0.01-0.17,P＜0.05）;术后30天GP73表达水平存在着统计学差异（校正均值0.18,95%CI 0.11-0.25,P＜0.001）。51例肝癌患者不同时间GP73、HIF-1α、HIF-2α表达水平的变化趋势之间的相关性如下,GP73与HIF-1α的变化趋势之间有强正相关关系（相关系数0.986,P＜0.001）。从两者的表达水平变化趋势图中也不难看出GP73与HIF-1α均在术后1天表达水平明显升高,随后至术后7天呈连续下降的趋势。不同TACE疗效组GP73变化量和GP73变化率的差异存在统计学差异（P＜0.001）;不同TACE疗效组AFP变化量和AFP变化率的差异不存在统计学差异（P=0.136、P=0.084）。根据二元logistic回归结果可以看出,肿瘤大小和GP73变化率是TACE治疗效果的独立影响因素（P=0.013,P=0.003）。TACE治疗术前1天GP73表达水平与肿瘤大小存在显著的正向相关关系（相关系数0.401,P＜0.05）。TACE治疗术前1天GP73表达水平与肿瘤个数、肝功能Child-Pugh分级、BCLC分期的相关关系不显著,P＞0.05。2第二部分:不同缺氧培养时间条件下,培养6h和培养14h的GP73分泌表达水平少量上升,没有显著的统计学差异（P＞0.05）。从14h开始,直到培养72h,GP73表达水平呈现明显的上升趋势,且有显著的统计学差异（P＜0.05）。培养至120h又出现明显的下降趋势。缺氧组细胞内GP73的表达水平鱼常氧组进行比较,从培养6h直到培养72h逐渐增加,在培养72h时达到峰值。缺氧培养120h时细胞内GP73表达水平较缺氧培养72h时明显下降,但仍高于常氧培养72h组。与常氧培养组72h相比较,缺氧培养组随着缺氧培养时间的增加,细胞内HIF-1α与HIF-2α的表达水平从缺氧培养6h直到缺氧培养48h逐渐增加,在缺氧培养48h时达到峰值,缺氧培养72h与缺氧培养120h的细胞内HIF-2α表达水平差异不大,均较缺氧培养48h组明显降低,但仍都高于常氧培养组。不同缺氧程度条件下,1%O2浓度时GP73分泌表达水平达到最高。不同缺氧梯度程度组的细胞内GP73表达水平与常氧培养组相比较均呈现较高水平。与常氧培养组相比较,10%O2组HIF-1α的表达水平明显高于前者,随着培养条件中氧气浓度的降低,缺氧程度逐渐加大,缺氧程度与HIF-1α的表达水平呈正相关关系。当氧气浓度降低至0%时,细胞生存环境极度缺氧状态,HIF-1α表达水平达到峰值。与常氧培养组相比较,HIF-2α的表达水平的变化表现出与HIF-1α表达水平相似的变化趋势。HIF-2α的表达水平在10%O2缺氧浓度培养时即升高,随着培养条件中氧气浓度的减少,缺氧程度逐渐加大,HIF-2α的表达水平也随之升高。当氧气浓度减少至0%时,细胞的生存环境中医不供给氧气,极度恶化,HIF-2α出现峰值。3第三部分:在缺氧环境下单纯抑制HIF-1α和单纯抑制GP73的表达,均会使TGF-β1的表达降低,磷酸化的Smad2（p-Smad2）与磷酸化的Smad3（p-Smad3）的表达降低,EMT相关蛋白分子表达量发生变化,其中E-钙黏蛋白（epithelial cadherin,E-cadherin）与波形蛋白（Vimentin）出现相反的变化表达。说明在缺氧环境下HIF-1α与GP73均会影响下游信号通路因子的变化并影响肝癌细胞发生EMT。进一步在缺氧+2ME2+过表达GP73组中,同时对HIF-1α及GP73进行调控。得到与分别单纯抑制HIF-1α与GP73相反的结果。结论:1 GP73在TACE治疗前后发生的变化是TACE治疗疗效的影响因素。GP73在TACE治疗前后发生的变化主要受到肿瘤大小的影响。GP73在TACE治疗前后的变化趋势与HIF-1α在TACE治疗前后发生的变化趋势之间有显著的正相关关系。为课题假设以及下一步体外细胞实验的开展找到临床证据。2不同缺氧浓度条件下的Hep G2细胞内GP73、HIF-1α及HIF-2α的表达水平变化趋势之间,GP73的峰值出现时间在HIF-1α及HIF-2α峰值出现之后,从时间的先后顺序上我们推断,在缺氧微环境下肝癌细胞内HIF-1α的表达调控GP73的表达。3调控实验肝癌细胞缺氧模型的培养条件,即1%O2+5%CO2+94%N2,培养时间72h。4在缺氧环境下HIF-1α调控GP73促进肝癌细胞发生EMT导致TACE预后不良,并且这个调控机制可能是通过GP73参与激活的TGF-β/Smad信号通路所介导的。