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背景糖尿病视网膜病变(Diabetic Retinopathy,DR)是一种严重的致盲性眼病。对于DR的早期治疗,尚缺乏有效的方法。视网膜小胶质细胞是视网膜的常驻免疫细胞,可以通过释放神经保护因子和抗炎因子参与免疫防御。视网膜微环境的细微变化即可引起小胶质细胞激活,活化的小胶质细胞可以通过释放大量炎症介质,进一步加重视网膜损伤。近年来,随着对DR的深入研究,越来越多的学者认为视网膜小胶质细胞的活化及其相关的炎症反应与DR的发病密切相关,如何在早期进行干预成为当前研究的热点。Fractalkine(FKN)是一种由神经元和内皮细胞表达和分泌的趋化因子,研究认为FKN能通过识别其独特的受体CX3C趋化因子受体1(CX3CR1)调控视网膜小胶质细胞的活化程度,DR模型中高表达的CX3CR1对神经元具有保护作用。骨髓间充质干细胞(BMSCs)具有神经保护、免疫调节及抗炎等特性,已被用于包括眼部在内的多种退行性病变的治疗。BMSCs能表达FKN,提示BMSCs与视网膜小胶质细胞之间存在信号交联,可能参与了视网膜小胶质细胞功能的调控。因此本研究基于FKN/CX3CR1轴,探讨FKN-BMSCs对糖尿病早期大鼠视网膜小胶质细胞及炎症反应的影响。第一部分糖尿病早期大鼠视网膜小胶质细胞活化及炎症反应的研究目的探究糖尿病早期大鼠视网膜小胶质细胞的活化情况及相关的炎症反应。方法取健康雄性SD大鼠,随机分为正常组和糖尿病模型组,模型组一次性腹腔注射STZ诱发高血糖,正常组腹腔注射等体积柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。注射后72 h检测大鼠血糖,≥16.7 mmol/L者视为造模成功。病程4w时,采用荧光素眼底血管造影(FFA)观察大鼠视网膜血管形态及渗漏情况;免疫荧光Iba1染色观察大鼠视网膜小胶质细胞的活化情况;Western blot检测大鼠视网膜炎性因子TNF-α、IL-1β的表达情况;Griess法检测视网膜NO的释放量;TUNEL法检测大鼠视网膜细胞凋亡情况。结果一次性腹腔注射STZ后,12只大鼠中有10只血糖维持在16.7mmol/L以上,并出现多饮、多食、多尿等糖尿病症状,造模成功率为83.3%。病程4w时,两组大鼠FFA检测均未观察到视网膜血管形态异常及渗漏。与正常组相比,模型组大鼠视网膜小胶质细胞明显活化;正常组和模型组视网膜小胶质细胞数分别为(11.33±1.21)、(14.83±1.47)个/视野,模型组高于正常组,差异有统计学意义(t=-4.498,P<0.05)。正常组TNF-α、IL-1β蛋白相对表达量分别为(0.34±0.03)、(0.29±0.04),模型组分别为(0.49±0.05)、(0.51±0.04),模型组较正常组两种蛋白表达均上调(t TNF-α=-6.550,t IL-1β=-6.789,P<0.05)。正常组大鼠视网膜NO浓度为(15.99±1.90)μmol/L,模型组大鼠视网膜NO浓度较正常组升高,为(50.59±3.50)μmol/L,两组比较差异有统计学意义(t=-21.296,P<0.05)。正常组大鼠视网膜TUNEL阳性细胞数量较少,为(3.11±1.05)个,模型组大鼠视网膜TUNEL阳性细胞数量较正常组明显增多,为(7.89±1.90)个,差异有统计学意义(t=-6.596,P<0.05)。结论1.一次性腹腔注射STZ能够建立稳定的糖尿病模型;2.病程4w的糖尿病大鼠已经出现视网膜小胶质细胞活化、炎症因子表达上调及凋亡细胞增加等病变。第二部分Fractalkine基因修饰的骨髓间充质干细胞对糖尿病早期大鼠视网膜炎症反应的影响目的评估视网膜下腔移植FKN-BMSCs对糖尿病早期大鼠视网膜小胶质细胞及炎症反应的影响。方法1.BMSCs的分离培养和鉴定:采用全骨髓贴壁法分离培养SD大鼠BMSCs,观察细胞形态,并进行成骨、成脂分化诱导和流式细胞术细胞表面标记物检测。2.FKN-BMSCs的构建:采用过表达FKN的慢病毒感染BMSCs,并检测FKN-BMSCs细胞上清液中FKN的含量。3.将造模成功的雄性SD大鼠随机分为4组:对照组、DMEM组、BMSCs组、FKN-BMSCs组。在病程4w时,DMEM组视网膜下腔注射2μLDMEM溶液;BMSCs组视网膜下腔注射2μL BMSCs细胞混悬液;FKN-BMSCs组视网膜下腔注射2μL FKN-BMSCs细胞混悬液;对照组不予处理。采用FFA观察大鼠视网膜血管形态及渗漏情况;免疫荧光Iba1染色观察大鼠视网膜小胶质细胞的活化情况;Western blot检测大鼠视网膜炎性因子TNF-α、IL-1β的表达情况;Griess法检测视网膜NO的释放量;TUNEL法检测大鼠视网膜细胞凋亡情况。结果1.BMSCs分离培养和鉴定:成功分离培养出SD大鼠BMSCs,细胞呈贴壁生长、形态均一,并能被诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞,流式细胞术检测显示BMCSs高表达CD29、CD44和CD90,几乎不表达CD11b/c、CD34和CD45。2.FKN-BMSCs的构建:过表达FKN的慢病毒可高效感染BMSCs,最佳感染复数(MOI)为40,感染效率达(82.82±2.45)%;FKN-BMSCs上清液中FKN的分泌量较BMSCs明显增加(P<0.05)。3.视网膜下腔移植后1w、3w各组大鼠FFA检测均未发现明显视网膜血管形态异常及渗漏。视网膜下腔移植BMSCs、FKN-BMSCs能减轻视网膜小胶质细胞活化增殖程度:移植后1w,视网膜切片染色显示对照组和DMEM组视网膜小胶质细胞部分呈胞体肥大,突起缩短变少的活化状态,BMSCs组、FKN-BMSCs组分枝状细胞居多,BMSCs组、FKN-BMSCs组视网膜小胶质细胞数量均低于对照组和DMEM组(F=22.331,均P<0.05),且FKN-BMSCs组低于BMSCs组(P<0.05)。移植后3w视网膜铺片中,BMSCs组、FKN-BMSCs组视网膜小胶质细胞覆盖面积比例均高于对照组和DMEM组(F=76.054,均P<0.05),且FKN-BMSCs组高于BMSCs组(P<0.05);FKN-BMSCs组小胶质细胞密度低于BMSCs组、对照组和DMEM组(F=120.100,均P<0.05)。移植后3w,BMSCs组、FKN-BMSCs组视网膜CX3CR1蛋白表达量较对照组和DMEM组上调,TNF-α、IL-1β蛋白表达量较对照组和DMEM组下调(FCX3CR1=85.280、FTNF-α=45.762、FIL-1β=34.727,均P<0.05),与移植BMSCs相比,移植FKN-BMSCs对三种蛋白的表达影响更大。BMSCs组、FKN-BMSCs组视网膜NO浓度低于对照组和DMEM组(F1w=68.229、F3w=153.146,均P<0.05),FKN-BMSCs组低于BMSCs组(P<0.05)。视网膜下腔移植BMSCs、FKN-BMSCs能抑制视网膜细胞凋亡,移植后3w,BMSCs组、FKN-BMSCs组视网膜TUNEL阳性细胞数低于对照组和DMEM组(F=85.876,均P<0.05),且FKN-BMSCs组低于BMSCs组(P<0.05)。结论1.SD大鼠骨髓中易分离培养出BMSCs,经细胞形态、分化潜能及表面标记物鉴定证实为BMSCs;2.慢病毒能够将FKN基因整合至BMSCs基因组中,从而构建过表达FKN的BMSCs;3.FKN基因修饰的BMSCs可能通过FKN/CX3CR1轴抑制糖尿病早期视网膜小胶质细胞活化、减轻视网膜炎症反应并抑制视网膜细胞凋亡。