小鼠抗App HtrA多克隆抗体的抗感染保护作用研究

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猪传染性胸膜肺炎(Porcine contagious pleuropneumonia,PCP)是具有传染性强、致死率高,严重破坏猪养殖业生产效益等特点的呼吸道传染性疾病。该病由猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,App)感染引起。主要引起肺部渗出性、出血性、坏死性肺炎损伤及相关胸膜炎等损伤。由于其血清型众多,致病机制复杂,临床上使用灭活疫苗保护效果不佳,因此寻找新的防治方法十分必要。HtrA蛋白是广泛表达于细菌中的分子,参与许多病原菌的致病过程,具备良好的免疫原性,因此其抗体可能具有对抗感染的保护作用。本研究依据Gen Bank中查询到的胸膜肺炎放线杆菌HtrA基因序列设计上下游引物,以猪胸膜肺炎放线杆菌血清Ⅰ型基因组DNA为模板PCR扩增HtrA基因片段,测序并分析,发现:该基因片段长1380bp,起始密码子为ATG,终止密码子为TAG,可表达一个由460个氨基酸组成的蛋白质。该蛋白的理论分子量为48.60KD,等电点为6.17。该蛋白在12-34氨基酸处有一跨膜螺旋区域,1-28氨基酸处存在一个信号肽,88-263氨基酸为其丝氨酸胰蛋白酶域,还含有两个PDZ结构域,与猪胸膜肺炎放线杆菌其他血清型HtrA有着很高的同源性,与其他病原菌也有很好的同源性。具有12个抗原表位,表明其可能具备很好的免疫原性及交叉保护力。将HtrA基因克隆到p ET28a(+)载体上,构建重组质粒p ET-HtrA,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)进行表达,Western blot鉴定表明,表达产物在48KD左右处有一特异性条带,与预期rHtrA蛋白大小相符,且能被相应猪感染阳性血清识别。使用rHtrA+弗氏不完全佐剂免疫小鼠,抗体水平检测结果显示,其具备着良好的免疫原性,可刺激机体产生高水平的抗体效价。纯化rHtrA的多克隆抗体IgG,处理细菌再感染小鼠,发现抗体处理后,App感染后引起的肺部炎症程度降低。可见,重组App血清Ⅰ型HtrA具备良好免疫原性,rHtrA的多克隆抗体IgG处理细菌再感染小鼠可降低肺部炎症程度。
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