副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus, Vp)是一种食源性致病菌,广泛分布于贝类及各种海产品中。Vp致病性菌株会引起伤口感染、败血症,或急性胃肠炎等疾病,出现腹泻、头痛、呕吐、恶心和腹部绞痛等,通常直接生食或半生食海产品,或者食用经Vp交叉感染的其他食品均会引发Vp食物中毒,可使免疫功能不全的人群引起严重的疾病,甚至死亡。Vp致病性菌株是引起亚洲国家,包括日本、中国等,食源性疾病的主要原因之一,也是在美国发生的海产品引起胃肠炎的主要原因。自2001以来,由于食用海产品引起的弧菌感染发病率持续增长,严重威胁公共健康。近年来,弧菌疾病爆发造成的水污染严重影响了个人、经济、社会以及公共健康卫生。O3：K6血清型作为吻流行性菌株最主要的血清型,可产生耐热性直接溶血素(TDH)或耐热性相关溶血素(TRH)。Vp具有两套Ⅲ型分泌系统T3SSs (I, II),可分泌效应蛋白到宿主细胞质,引起细胞毒性和肠毒性。研究表明Vp大流行株中存在毒力岛(Vpals),可引起人和动物的肠道积水、水性腹泻等疾病。尽管目前Vp引起腹泻的具体机制尚不清楚,但肠道疾病与毒力特性(如黏附性)和其他毒力因子(如胞外酶、毒素TDH/TRH)有关。这些毒力因子为细胞毒素和肠毒素,已被多种细胞模型和动物模型证实,然而,毒力因子是否具有宿主特异性仍不清楚。而且,Vp流行菌株的原宿主鲜有报道,其主要原因是与其它食源性疾病相比,对致病性的不完全理解,包括环境、海产品分离株与临床分离株的联系。Vp感染与社会经济状态、气象改变、供水质量以及公共环境卫生并没有相关性。比较研究流行菌株和非流行菌株的差异性,虽可显示流行菌株的演变,但目前尚不能明确地阐明其出现的原因。本研究利用非吞噬细胞系建立了体外细胞感染模型,比较了副溶血性弧菌临床分离菌株与环境菌株诱导的细胞毒性效应及其评价指标。在此基础上,对Vp基因组中的部分推测的与致病性相关的基因进行了敲除,研究其对细胞毒性和肠毒性的影响及其可能的作用机制,并应用幼兔感染模型进行结果验证。通过体外免疫试验对副溶血性弧菌的先天性免疫特性进行了研究,研究结果为Vp菌株的毒力评价及致病性分子机制的理解提供了新的方法与依据。我们对5株副溶血性弧菌菌株的毒力基因tdh、trh、tlh和orf8以及生长特征进行研究,结果显示分离株Vp024、Vp038和大流行株RIMD2210633(血清型O3：K6)具有相同的基因型,均为tlh+tdh+trh-orf8+,分离株Vp005基因型为tlh+tdh+trh-orf8-,分离株Vp029 tlh+tdh-trh-orf8-,菌株Vp038在37℃有氧培养条件下显示了较高的最大群体密度,其它菌株具有相似的生长特性,所有菌株在0-2h内增殖倍数没有显著差异(p>0.05)。应用非吞噬细胞系Caco-2建立体外感染模型测定了5株分离株的细胞毒性,结果发现：细胞在感染后的不同阶段和不同菌株之间差异程度不同,其中感染60min,不同菌株的黏附指数和侵袭指数均具有显著差异,分离株Vp024和Vp005黏附指数显著高于其它菌株(p<0.05)；Vp024的侵袭指数显著高于对照菌株和其它分离株(p<0.01),但感染180min后菌株间差异性不显著。对模型细胞的胞内活性氧(reactive oxygen species, ROS)、一氧化氮(nitric oxide, NO)、pH、钙离子(Ca2+)以及线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential, MMP)水平测定结果显示：Caco-2细胞感染副溶血性弧菌后,胞内Ca2+水平明显增加,NO水平显著下降,但不同菌株之间没有显著差异；但胞内ROS、pH和MMP水平变化具有菌株依赖性。对细胞诱导凋亡结果显示,分离株Vp024、Vp005和Vp029共培养3h诱导凋亡率显著高于大流行株RIMD2210633。我们的研究结果表明所有副溶血性弧菌(包括大流行株和环境株)均能黏附和侵入非吞噬性上皮细胞,并且能够通过调节胞内ROS在胞内存活和复制,最终导致细胞损伤,这种副溶血性弧菌诱导的细胞损伤并不依赖于经典的细胞凋亡机制。在此基础上我们通过构建RIMD2210633基因缺失株以及体外细胞模型进一步研究了宿主细胞对毒力相关基因VPA1656、VP2118和VPA1321的反应,及其可能的致病性分子机制。弧菌铁调节受体蛋白编码基因VPA1656在正常情况对副溶血性弧菌细胞毒性和肠毒性没有影响。铁调节受体蛋白编码基因VPA1656与该菌在体内铁离子摄取有关,在铁限制的条件下,通过利用胞内铁元素作为铁离子来源,造成细胞损伤。我们构建了RIMD2210633基因缺失株(RIMDΔVPA1656)并比较研究了VPA1656基因缺失株和野生型菌株的细胞毒性和肠毒性。结果表明突变株也能够黏附和侵入体外培养的细胞,感染细胞的ROS、NO和胞内pH参数下降水平显著高于未感染细胞,Ca+2和MMP水平显著高于对照细胞。而突变株诱导的LDH释放和细胞死亡率和亲本株没有显著区别。此外在幼兔体内感染模型中,细菌的定植、存活以及肠液积水率均与亲本株没有显著区别,组织病理学观察显示突变株和亲本株均能够引起感染动物大部分肠道的坏死。在Vp基因组中有三个基因与Vp的抗氧化性胁迫有关,其中VP2118是抗氧化胁迫的主要基因,但是VP2118与其在胞内的存活和致病性的关系尚不清楚。我们发现肠道细胞中的活性氧水平对副溶血性弧菌的胞内存活具有重要作用。为了理解VP2118基因对副溶血性弧菌的胞内存活和致病性的作用。我们构建了VP2118基因敲除菌株(RIMDΔVP2118)并研究了突变株在体外Caco-2细胞模型和幼兔模型中的毒性。结果显示RIMDΔVP2118的SOD活性显著降低,并且通过基因互补可以回复突变。与野生菌株相比,RIMDΔVP2118黏附和侵袭指数以及对ROS的抵抗力显著降低,通过VP2118基因互补可恢复感染能力。RIMDΔVP2118对非吞噬细胞的细胞毒性效应显著下降,诱导LDH、细胞凋亡以及细胞死亡率显著降低于亲本株；而且,细菌在体内的生长和存活率相对于亲本株有所下降；突变株诱导幼兔肠液积水率显著降低,组织病理观察显示：感染野生菌株的幼兔肠道细胞坏死,而感染RIMDΔVP2118的幼兔大部分肠道内壁仅出现局部轻微的细胞坏死。RIMDΔVP2118感染人非吞噬细胞,可刺激产生促炎因子和抗炎细胞因子的分泌,与亲本株相比,突变株诱导的细胞因子释放显著减弱(p<0.01)。通过对比分析我们还发现体外的细胞毒性参数与幼兔模型中的肠毒性参数(体内细菌存活率和肠液累积率)呈正相关。结果表明FeSOD基因(VP2118)主要通过提高副溶血性弧菌对非吞噬性肠上皮细胞产生的ROS抗性,在动物模型中提高了Vp在肠道中的存活率,进一步提高了对宿主组织感染能力。VPA1321编码Ⅲ型分泌系统效应蛋白,与Yersinia spp.和致病性大肠杆菌的细胞毒素高度同源,被认为是主要的细胞毒性相关因子,但是我们的研究结果表明VPA1321对Vp在体外细胞感染模型中的毒力并没有起主导作用。VPA1321基因敲除菌株(RIMDΔVPA1321)与亲本株具有显著差异性,突变株的细胞侵袭能力显著下降；但仍然具有黏附细胞单层的能力。此外突变株在调节体外细胞模型参数(ROS, NO, pH, Ca+2,和MMP)以及诱导细胞释放LDH等方面和亲本株没有显著差异,亲本株和突变株均能够导致完整细胞的破坏。本论文利用FACS研究了Vp临床分离株对非吞噬细胞的细胞毒性效应。肠道致病菌获得逃避宿主的先天性反应的适应性有助于其致病能力,并且防止其被快速消除,Vp的致病性是基于其黏附和入侵,我们通过感染细胞中ROS的变化证实增大Vp的ROS抵抗能力可促进Vp在肠道中的存活,抑制宿主的氧化应激反应,促进组织感染。幼兔感染模型证实：Vp假设的超氧化物歧化酶(SODs)对耐受体内氧化应激反应具有重要作用,Vp可诱导抗氧化胁迫酶FeSOD基因(VP2118)与促进Vp在肠道中的存活、促进组织感染密切相关,是产生体外细胞毒性和体内肠毒性不可或缺的毒力因子。