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目的:通过AM12质粒(含HBV3.2kb全基因组)转染体外培养的人近端肾小管上皮细胞(HK-2),观察HK-2细胞表型转化、凋亡、Fas表达及对转化生长因子-β1(TGF-β1)分泌的影响,初步探讨乙型肝炎病毒(HBV)在乙型肝炎病毒相关性肾炎(HBV-GN)肾损伤中的作用及机理,为临床预防或/和治疗HBV-GN提供实验性理论依据。
方法:将HK-2细胞于培养瓶中培养至80%-90%融合,0.25%胰酶消化,以1×106/ml传代于细胞培养板中,在37℃、5%CO2、95%空气的条件下贴壁并培养至80%-90%融合后,以含HBV3.2 kb全基因组的AM12质粒转染HK-2细胞为转染组,以正常HK-2细胞作为阴性对照组、HK-2细胞与慢性乙肝患者血清共同培养作为阳性对照组:
1.将HK-2细胞以1×106/ml传代于24孔培养板中,以AM12质粒转染HK-2细胞,37℃、5%CO2、95%空气的条件下继续培养5天,采用时间分辨免疫荧光法检测HBsAg、HBeAg的表达;
2.将HK-2细胞以1×106/ml传代于6孔培养板中,分对照组、转染组,以37℃、5%CO2、95%空气的条件继续培养3天后,以0.25%胰酶消化收集细胞,70%冷酒精固定24小时,用PBS重悬细胞,调节细胞浓度约1×106/ml,碘化丙啶(PI)避光染色1小时,以流式细胞仪检测HK-2凋亡情况;
3.将HK-2细胞以1×106/ml传代于6孔培养板中,分对照组、转染组,以37℃、5%CO2、95%空气的条件继续培养3天后,以0.25%胰酶消化收集细胞,用PBS重悬细胞,调节细胞浓度约1×106/ml,加入CD95-FITC鼠抗人单克隆抗体,室温避光反应20分钟,以流式细胞仪检测HK-2 Fas表达情况;
4.将HK-2细胞以1×106/ml传代于24孔培养板中,分对照组、转染组,以37℃、5%CO2、95%空气的条件继续培养3天后,采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测上清液中转化生长因子-β1(TGF-β1)的浓度。于波长450nm的酶标仪上读取标准品OD值,以标准品OD值与标准品0点OD值的比率为纵坐标,以标准品的浓度为横坐标,采用SPSS软件拟合标准曲线,通过检测标本的OD值在标准曲线上查出其浓度值;
5.将HK-2细胞以1×106/ml传代于预置玻片的6孔培养板中,分转染组、阳性对照组、阴性对照组,以37℃、5%CO2、95%空气的条件继续培养3天后,取出玻片进行免疫组化染色,检测角蛋白(CK)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达,胞浆呈棕黄色为阳性,并对染色后细胞进行显微镜下观察,摄片,Image-Pro Plus软件分析平均光密度,进行相对定量。
结果:
1.转染5天后可在其中一孔中检测到乙肝抗原的表达,其HBsAg的荧光强度为73245,浓度为5.377 ng/ml;HBeAg的荧光强度为92746,浓度为0.890NCU/ml。
2.对照组HK-2凋亡率为1.03±0.09%,转染组为1.49±0.02%,转染组凋亡率高于对照组(P<0.05)。
3.对照组HK-2Fas表达率为6.58±0.65%,转染组为10.09±2.34%,转染组HK-2 Fas表达率明显高于对照组(P<0.05)。
4.阴性对照组TGF-β1水平为210.28±47.21pg/ml,转染组为283.85±61.12 pg/ml,转染组TGF-β1水平高于对照组(P<0.05)。
5.阴性对照组HK-2角蛋白表达强阳性,阳性对照组与转染组呈弱阳性,平均光密度值分别为0.078±0.017、0.068±0.029、0.069±0.035,u值分别为12.000(阴性组vs.转染组)、4.067(转染组vs.阳性组),差异均有显著性(P<0.05);阴性对照组α-平滑肌肌动蛋白表达阴性,阳性对照组与转染组呈强阳性,平均光密度值分别为0.034±0.011、0.122±0.031、0.094±0.037,u值分别为26.914(阴性组vs.转染组)、10.045(转染组vs.阳性组),各组间比较差异有显著性(P<0.05)。
结论:
1.含3.2kb全基因组的HBV-DNA质粒可转染人肾小管上皮细胞,并引起肾小管上皮细胞损伤。
2.HBV-DNA质粒转染人肾小管上皮细胞可导致肾小管上皮细胞凋亡增加,Fas表达升高。
3.HBV-DNA质粒转染人肾小管上皮细胞可引起TGF-β1分泌增加。
4.HBV-DNA质粒转染人肾小管上皮细胞可导致肾小管上皮细胞转分化。
故推测乙肝病毒可在肾小管上皮细胞原位复制及表达,并通过Fas/FasL途径介导肾小管上皮细胞凋亡及发生上皮.间叶的转分化,引起肾小管上皮细胞损伤,使TGF-β1分泌增多,反过来又促进肾小管上皮细胞表型转化和凋亡增加,造成肾小管上皮细胞的进一步损伤。