论文部分内容阅读
研究背景：
急性肾损伤(Acute Kidney Injury，AKI)是指由多种因素导致的短期内肾脏功能急速下降而出现的一种严重的临床综合征。急性肾损伤的发生常伴随着患者住院时间的延长、医疗花费的增加、发病率和病死率的升高。导致AKI的原因很多，脓毒症是其中最常见的病因之一。脓毒症性AKI发病机制非常复杂，目前研究发现其机制涉及：炎症介质的释放、氧化应激会增加肾小管损伤，肾血流动力学的改变、肾灌注不足会导致肾损伤，微循环功能障碍及细胞凋亡也参与了发病进程。在脓毒症性AKI的上述发病机制里，炎症介质的过度释放是脓毒症引起AKI发生的主要诱因。因此，抑制炎症反应可能是改善脓毒症诱发的AKI途径之一。
E盒结合锌指蛋白2(Zinc finger E-box Binding homeobox 2，ZEB2)属于锌指结构转录因子中的E盒结合锌指蛋白家族的成员，包含了与各种转录共同效应子相互作用的大部分功能域。ZEB2不仅在细胞核内，其在细胞的胞浆以及其胞核中均存在表达。ZEB2参与了细胞的炎症反应以及细胞的形成、生长、分化、凋亡等多个生命代谢调控过程。ZEB2在肝癌、乳腺癌、胃癌和卵巢癌等人类肿瘤中均有异常表达。炎症因子(如肿瘤坏死因子-α，简称TNF-α)等促进了脓毒症性AKI的发生发展。TNF-α、IL-6、TGF-β和许多信号通路同样参与了ZEB2的表达。本课题组前期研究发现，ZEB2可以抑制RAW264.7和小鼠原代巨噬细胞中炎症因子TNF-α和IL-6的释放。
目的：
探讨ZEB2在脓毒症性AKI中的表达变化及对LPS诱导的HK-2细胞炎症因子分泌的影响，为ZEB2在LPS诱导的炎症中的作用机制深入研究提供理论和实验依据。
方法与结果：
本课题通过对C57BL/6小鼠腹腔注射LPS构建脓毒症性AKI动物模型、LPS刺激HK-2细胞作为细胞模型来开展研究，本研究内容如下：
1.ZEB2在LPS诱导的小鼠脓毒症性急性肾损伤中的变化
将C57BL/6小鼠常规饲养1周后随机分成两组，对照组(Control组)有10只，模型组(LPS组)有20只。模型组(LPS组)小鼠通过腹腔内注射LPS(15mg/kg)建立脓毒症性AKI小鼠模型，对照组(Control组)小鼠腹腔内注射等量PBS。24h后麻醉心脏取血，检测血清中Scr和BUN水平，并进行肾脏组织病理学HE染色，qPCR检测KIM-1的mRNA表达，qPCR和Westernblot检测ZEB2、TNF-α、IL-6的mRNA和蛋白表达。
结果发现：模型组(LPS组)小鼠血清中Scr和BUN水平明显高于对照组(Control组)，模型组(LPS组)肾脏组织病理学结果显示肾脏间质弥漫性小血管扩张充血，肾毛细血管球萎缩，肾小球囊扩张，弥漫性肾近曲小管上皮细胞水肿，肾小管腔呈星芒状或者肾小管闭塞，且模型组(LPS组)小鼠肾脏组织中KIM-1的mRNA表达明显升高，上述结果提示LPS诱导的小鼠脓毒症性急性肾损伤模型构建成功。采用qPCR和Westernblot检测发现，模型组(LPS组)ZEB2的mRNA和蛋白表达明显降低，而模型组(LPS组)炎症因子TNF-α和IL-6的mRNA和蛋白表达明显升高。
2.ZEB2在LPS诱导的HK-2细胞中炎症因子的分泌及可能机制
采用不同浓度的LPS(0.1，1，10ug/ml)刺激HK-2细胞，24h后采用qPCR和Westernblot检测HK-2细胞中ZEB2以及TNF-α和IL-6的mRNA和蛋白表达；采用小干扰RNA(siRNA)和质粒转染技术建立沉默和过表达ZEB2的细胞模型，用LPS(1μg/ml)刺激HK-2细胞24h后，通过qPCR和Westernblot检测HK-2细胞中炎症因子TNF-α和IL-6的mRNA和蛋白表达；此外，为了进一步探讨ZEB2对LPS诱导的HK-2细胞中炎症因子分泌的可能机制，采用Westernblot检测NF-κB信号通路相关蛋白(p-p65和p-IκBα)的表达。
结果发现：LPS刺激的HK-2细胞中ZEB2的mRNA和蛋白表达明显下降，而TNF-α和IL-6的mRNA和蛋白表达明显升高。沉默ZEB2时，HK-2细胞中TNF-α和IL-6的mRNA和蛋白表达升高，p-p65和p-IκBα的蛋白表达也升高，而过表达ZEB2时，HK-2细胞中TNF-α和IL-6的mRNA和蛋白表达减少，p-p65和p-IκBα的蛋白表达也降低。
结论：
1.ZEB2在脓毒症性AKI中表达下降，可能参与了炎症因子分泌的调控。
2.ZEB2可能通过抑制NF-κB信号通路减弱了LPS诱导的HK-2细胞中炎症因子TNF-α和IL-6的分泌。
急性肾损伤(Acute Kidney Injury，AKI)是指由多种因素导致的短期内肾脏功能急速下降而出现的一种严重的临床综合征。急性肾损伤的发生常伴随着患者住院时间的延长、医疗花费的增加、发病率和病死率的升高。导致AKI的原因很多，脓毒症是其中最常见的病因之一。脓毒症性AKI发病机制非常复杂，目前研究发现其机制涉及：炎症介质的释放、氧化应激会增加肾小管损伤，肾血流动力学的改变、肾灌注不足会导致肾损伤，微循环功能障碍及细胞凋亡也参与了发病进程。在脓毒症性AKI的上述发病机制里，炎症介质的过度释放是脓毒症引起AKI发生的主要诱因。因此，抑制炎症反应可能是改善脓毒症诱发的AKI途径之一。
E盒结合锌指蛋白2(Zinc finger E-box Binding homeobox 2，ZEB2)属于锌指结构转录因子中的E盒结合锌指蛋白家族的成员，包含了与各种转录共同效应子相互作用的大部分功能域。ZEB2不仅在细胞核内，其在细胞的胞浆以及其胞核中均存在表达。ZEB2参与了细胞的炎症反应以及细胞的形成、生长、分化、凋亡等多个生命代谢调控过程。ZEB2在肝癌、乳腺癌、胃癌和卵巢癌等人类肿瘤中均有异常表达。炎症因子(如肿瘤坏死因子-α，简称TNF-α)等促进了脓毒症性AKI的发生发展。TNF-α、IL-6、TGF-β和许多信号通路同样参与了ZEB2的表达。本课题组前期研究发现，ZEB2可以抑制RAW264.7和小鼠原代巨噬细胞中炎症因子TNF-α和IL-6的释放。
目的：
探讨ZEB2在脓毒症性AKI中的表达变化及对LPS诱导的HK-2细胞炎症因子分泌的影响，为ZEB2在LPS诱导的炎症中的作用机制深入研究提供理论和实验依据。
方法与结果：
本课题通过对C57BL/6小鼠腹腔注射LPS构建脓毒症性AKI动物模型、LPS刺激HK-2细胞作为细胞模型来开展研究，本研究内容如下：
1.ZEB2在LPS诱导的小鼠脓毒症性急性肾损伤中的变化
将C57BL/6小鼠常规饲养1周后随机分成两组，对照组(Control组)有10只，模型组(LPS组)有20只。模型组(LPS组)小鼠通过腹腔内注射LPS(15mg/kg)建立脓毒症性AKI小鼠模型，对照组(Control组)小鼠腹腔内注射等量PBS。24h后麻醉心脏取血，检测血清中Scr和BUN水平，并进行肾脏组织病理学HE染色，qPCR检测KIM-1的mRNA表达，qPCR和Westernblot检测ZEB2、TNF-α、IL-6的mRNA和蛋白表达。
结果发现：模型组(LPS组)小鼠血清中Scr和BUN水平明显高于对照组(Control组)，模型组(LPS组)肾脏组织病理学结果显示肾脏间质弥漫性小血管扩张充血，肾毛细血管球萎缩，肾小球囊扩张，弥漫性肾近曲小管上皮细胞水肿，肾小管腔呈星芒状或者肾小管闭塞，且模型组(LPS组)小鼠肾脏组织中KIM-1的mRNA表达明显升高，上述结果提示LPS诱导的小鼠脓毒症性急性肾损伤模型构建成功。采用qPCR和Westernblot检测发现，模型组(LPS组)ZEB2的mRNA和蛋白表达明显降低，而模型组(LPS组)炎症因子TNF-α和IL-6的mRNA和蛋白表达明显升高。
2.ZEB2在LPS诱导的HK-2细胞中炎症因子的分泌及可能机制
采用不同浓度的LPS(0.1，1，10ug/ml)刺激HK-2细胞，24h后采用qPCR和Westernblot检测HK-2细胞中ZEB2以及TNF-α和IL-6的mRNA和蛋白表达；采用小干扰RNA(siRNA)和质粒转染技术建立沉默和过表达ZEB2的细胞模型，用LPS(1μg/ml)刺激HK-2细胞24h后，通过qPCR和Westernblot检测HK-2细胞中炎症因子TNF-α和IL-6的mRNA和蛋白表达；此外，为了进一步探讨ZEB2对LPS诱导的HK-2细胞中炎症因子分泌的可能机制，采用Westernblot检测NF-κB信号通路相关蛋白(p-p65和p-IκBα)的表达。
结果发现：LPS刺激的HK-2细胞中ZEB2的mRNA和蛋白表达明显下降，而TNF-α和IL-6的mRNA和蛋白表达明显升高。沉默ZEB2时，HK-2细胞中TNF-α和IL-6的mRNA和蛋白表达升高，p-p65和p-IκBα的蛋白表达也升高，而过表达ZEB2时，HK-2细胞中TNF-α和IL-6的mRNA和蛋白表达减少，p-p65和p-IκBα的蛋白表达也降低。
结论：
1.ZEB2在脓毒症性AKI中表达下降，可能参与了炎症因子分泌的调控。
2.ZEB2可能通过抑制NF-κB信号通路减弱了LPS诱导的HK-2细胞中炎症因子TNF-α和IL-6的分泌。