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硒（Se）元素作为一种人体新陈代谢过程必需的微量元素，在人体各种生理活动和生化反应过程中发挥重要作用[1]。含硒化合物表现出强的抗氧化和抗癌活性、增强免疫力、肝脏保护等作用[2]。螺旋藻作为一种优质的硒载体[3-5]，富硒螺旋藻蛋白（SeSP）已被证实在清除自由基、抗氧化、抗肿瘤、免疫调节等方面具有强大作用[6]。蛛网膜下腔出血（SAH）指由于脑底部以及脑表面异常血管由于多种原因引起破裂破裂，血液流出血管，进入并充满蛛网膜下腔而引起的一种具有极大危害的综合征[7]，SAH发病率高、高致残性、愈后困难[6,8],多数患者留有后遗症，正常生活严重受影响，给患者家庭和社会带来很大负担。蛛网膜下腔出血的治疗一直受到广泛关注，找到疗效确切、具有广泛临床应用潜力的药物或治疗手段已成为人们关注的焦点。本课题以无机硒亚硒酸钠培养螺旋藻，提取螺旋藻蛋白，用胰蛋白酶消化处理得到胰酶处理的富硒螺旋藻蛋白（Trypsin-SeSP），应用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）测定原代神经元、脑组织、及重要组织器官中硒含量，检测组织分布，并且探讨Trypsin-SeSP对SAH后的神经元保护作用及其机制。
研究目的：
1.制备酶解的小分子多肽Trypsin-SeSP，提取分离海马部位原代神经元细胞，为后续进行组织分布及SAH后保护作用的机制研究提供基础。
2.建立一种测定细胞、组织中Se元素含量的高效、准确、可靠的ICP-MS方法；评估Trypsin-SeSP对细胞膜的透过作用和组织分布。
3.探究Trypsin-SeSP在SAH后透过血脑屏障、进入神经元细胞发挥作用的机制，阐明Trypsin-SeSP对自由基产生、半胱天冬酶、线粒体膜电位等的影响。
4.综合评定Trypsin-SeSP对大鼠SAH的治疗效果。
研究方法：
1.以无机亚硒酸钠逐步加硒法培养螺旋藻，从富硒螺旋藻中提取SeSP，用0.25%胰酶消化SeSP制得Trypsin-SeSP；用SD大鼠出生24h内的乳鼠提取海马部位的原代神经元细胞，应用神经元特异性荧光探针Tululin荧光染色，鉴定原代神经元细胞。
2.原代神经元细胞分为3组，分别经Trypsin-SeSP、SeSP、螺旋藻蛋白（SP）处理，测定0h、2h、4h、6h、12h、24h后用ICP-MS测定神经元细胞内的Se元素的含量；SD大鼠分为4组，建立SAH的大鼠模型，给予30mg/kg/d Trypsin-SeSP、SP、SeSP、PBS治疗3d，断头处死，取脑、肝、肺、肾、心脏组织，微波消解，采用ICP-MS测定组织中Se含量的变化，评价Trypsin-SeSP透过细胞膜的作用及体内组织分布。
3.原代神经元细胞用0、2.5、5、10、20、40μg/ml浓度梯度的Trypsin-SeSP培养，用CCK-8试剂盒和酶标仪检测细胞活性，评估Trypsin-SeSP对原代神经元存活时间的影响。原代神经元细胞用0、2.5、5、10、20、40、80μg/ml的氧合血红蛋白（Oxy-Hb）培养，用CCK-8试剂盒和酶标仪检测神经元活性，评价Oxy-Hb对神经元细胞的毒性作用；原代神经元细胞分为4组，正常神经元细胞对照组，Oxy-Hb损伤神经元细胞组，Oxy-Hb损伤神经元细胞后进行Trypsin-SeSP保护组，Oxy-Hb损伤神经元细胞后进行SeSP保护组，检测神经元细胞活性的变化，评价Trypsin-SeSP在Oxy-Hb条件下对神经元细胞的保护作用。原代神经元细胞分为4组，正常神经元细胞对照组，Oxy-Hb损伤神经元细胞组，Oxy-Hb损伤神经元细胞后进行Trypsin-SeSP保护组，Trypsin-SeSP作用神经元细胞组，四组细胞采用Tubulin、TUNEL-DAPI、Mito-traker、JC-1、DCFH-DA、DHE特异性荧光探针进行免疫荧光染色并检测Caspase-3活性变化，探究Oxy-Hb存在下Trypsin-SeSP发挥神经元保护作用的机制。正常SD大鼠、SAH模型的SD大鼠及SAH后给予30mg/kg/d Trypsin-SeSP治疗3d的SD大鼠，断头处死取脑组织，制冰冻切片，应用特异性荧光探针NeuN、TUNEL-DAPI、Acive-Caspase-3免疫荧光染色，观察荧光变化，探究动物水平SAH后Trypsin-SeSP发挥神经保护作用的机制。
4.SD大鼠、SAH模型SD大鼠、SAH模型后Trypsin-SeSP治疗的SD大鼠，进行神经功能学评分，评价Trypsin-SeSP对SAH后神经功能紊乱的改善作用；麻醉、断头、取脑，脑组织在50℃恒温箱进行干湿重检测，测定脑组织干湿重、评价Trypsin-SeSP对脑水肿产生的抑制作用。
研究结果：
1.螺旋藻的形态和特异性荧光特性证明实验培养所得为富硒螺旋藻；神经元细胞的形态及特异性荧光探针Tululin显示提取所得为原代神经元细胞。
2.Trypsin-SeSP处理神经元细胞及SAH后Trypsin-SeSP治疗的SD大鼠的脑组织中Se元素含量明显上升；Trypsin-SeSP在SD大鼠的肝脏和肾脏的分布较多。
3.Oxy-Hb处理神原代经元细胞，神经元细胞形态学变化为胞体收缩、细胞数目减少、突起断裂、胞体空泡化和细胞间联系减少；Oxy-Hb诱导线粒体膜电位降低、半胱天冬酶激活、自由基产生，但Trypsin-SeSP可抑制Oxy-Hb诱导的神经元细胞发生的上述变化，证明Oxy-Hb诱导神经元细胞凋亡能被Trypsin-SeSP有效的抑制。SAH模型后给予Trypsin-SeSP治疗的SD大鼠冰冻切片免疫荧光染色结果显示：Trypsin-SeSP抑制SAH后细胞凋亡的发生。
4.Trypsin-SeSP可以明显改善蛛网膜下腔出血后出现的神经功能紊乱，改善SAH后SD大鼠的自发活动、反应性、灵敏性、动作幅度等；Trypsin-SeSP明显抑制SAH后脑组织脑水肿的发生，使SAH血肿周围脑组织中的水分减少，抑制脑损伤的发生。
研究结论：
1.所得原代神经元和富硒螺旋藻蛋白品系纯正。
2.Trypsin-SeSP可以透过细胞膜和血脑屏障在发生SAH后发挥神经保护作用；Trypsin-SeSP进入机体后进入脑组织发挥神经保护作用，经肝脏进代谢、肾脏排泄；ICP-MS法测定细胞和组织中Se元素的方法可靠。
3.Trypsin-SeSP能够抑制氧化应激诱导产生的神经元细胞凋亡，保护SAH后神经元。
4.Trypsin-SeSP抑制SAH后神经功能损伤，减弱脑水肿的发生具有显著治疗效果。
研究目的：
1.制备酶解的小分子多肽Trypsin-SeSP，提取分离海马部位原代神经元细胞，为后续进行组织分布及SAH后保护作用的机制研究提供基础。
2.建立一种测定细胞、组织中Se元素含量的高效、准确、可靠的ICP-MS方法；评估Trypsin-SeSP对细胞膜的透过作用和组织分布。
3.探究Trypsin-SeSP在SAH后透过血脑屏障、进入神经元细胞发挥作用的机制，阐明Trypsin-SeSP对自由基产生、半胱天冬酶、线粒体膜电位等的影响。
4.综合评定Trypsin-SeSP对大鼠SAH的治疗效果。
研究方法：
1.以无机亚硒酸钠逐步加硒法培养螺旋藻，从富硒螺旋藻中提取SeSP，用0.25%胰酶消化SeSP制得Trypsin-SeSP；用SD大鼠出生24h内的乳鼠提取海马部位的原代神经元细胞，应用神经元特异性荧光探针Tululin荧光染色，鉴定原代神经元细胞。
2.原代神经元细胞分为3组，分别经Trypsin-SeSP、SeSP、螺旋藻蛋白（SP）处理，测定0h、2h、4h、6h、12h、24h后用ICP-MS测定神经元细胞内的Se元素的含量；SD大鼠分为4组，建立SAH的大鼠模型，给予30mg/kg/d Trypsin-SeSP、SP、SeSP、PBS治疗3d，断头处死，取脑、肝、肺、肾、心脏组织，微波消解，采用ICP-MS测定组织中Se含量的变化，评价Trypsin-SeSP透过细胞膜的作用及体内组织分布。
3.原代神经元细胞用0、2.5、5、10、20、40μg/ml浓度梯度的Trypsin-SeSP培养，用CCK-8试剂盒和酶标仪检测细胞活性，评估Trypsin-SeSP对原代神经元存活时间的影响。原代神经元细胞用0、2.5、5、10、20、40、80μg/ml的氧合血红蛋白（Oxy-Hb）培养，用CCK-8试剂盒和酶标仪检测神经元活性，评价Oxy-Hb对神经元细胞的毒性作用；原代神经元细胞分为4组，正常神经元细胞对照组，Oxy-Hb损伤神经元细胞组，Oxy-Hb损伤神经元细胞后进行Trypsin-SeSP保护组，Oxy-Hb损伤神经元细胞后进行SeSP保护组，检测神经元细胞活性的变化，评价Trypsin-SeSP在Oxy-Hb条件下对神经元细胞的保护作用。原代神经元细胞分为4组，正常神经元细胞对照组，Oxy-Hb损伤神经元细胞组，Oxy-Hb损伤神经元细胞后进行Trypsin-SeSP保护组，Trypsin-SeSP作用神经元细胞组，四组细胞采用Tubulin、TUNEL-DAPI、Mito-traker、JC-1、DCFH-DA、DHE特异性荧光探针进行免疫荧光染色并检测Caspase-3活性变化，探究Oxy-Hb存在下Trypsin-SeSP发挥神经元保护作用的机制。正常SD大鼠、SAH模型的SD大鼠及SAH后给予30mg/kg/d Trypsin-SeSP治疗3d的SD大鼠，断头处死取脑组织，制冰冻切片，应用特异性荧光探针NeuN、TUNEL-DAPI、Acive-Caspase-3免疫荧光染色，观察荧光变化，探究动物水平SAH后Trypsin-SeSP发挥神经保护作用的机制。
4.SD大鼠、SAH模型SD大鼠、SAH模型后Trypsin-SeSP治疗的SD大鼠，进行神经功能学评分，评价Trypsin-SeSP对SAH后神经功能紊乱的改善作用；麻醉、断头、取脑，脑组织在50℃恒温箱进行干湿重检测，测定脑组织干湿重、评价Trypsin-SeSP对脑水肿产生的抑制作用。
研究结果：
1.螺旋藻的形态和特异性荧光特性证明实验培养所得为富硒螺旋藻；神经元细胞的形态及特异性荧光探针Tululin显示提取所得为原代神经元细胞。
2.Trypsin-SeSP处理神经元细胞及SAH后Trypsin-SeSP治疗的SD大鼠的脑组织中Se元素含量明显上升；Trypsin-SeSP在SD大鼠的肝脏和肾脏的分布较多。
3.Oxy-Hb处理神原代经元细胞，神经元细胞形态学变化为胞体收缩、细胞数目减少、突起断裂、胞体空泡化和细胞间联系减少；Oxy-Hb诱导线粒体膜电位降低、半胱天冬酶激活、自由基产生，但Trypsin-SeSP可抑制Oxy-Hb诱导的神经元细胞发生的上述变化，证明Oxy-Hb诱导神经元细胞凋亡能被Trypsin-SeSP有效的抑制。SAH模型后给予Trypsin-SeSP治疗的SD大鼠冰冻切片免疫荧光染色结果显示：Trypsin-SeSP抑制SAH后细胞凋亡的发生。
4.Trypsin-SeSP可以明显改善蛛网膜下腔出血后出现的神经功能紊乱，改善SAH后SD大鼠的自发活动、反应性、灵敏性、动作幅度等；Trypsin-SeSP明显抑制SAH后脑组织脑水肿的发生，使SAH血肿周围脑组织中的水分减少，抑制脑损伤的发生。
研究结论：
1.所得原代神经元和富硒螺旋藻蛋白品系纯正。
2.Trypsin-SeSP可以透过细胞膜和血脑屏障在发生SAH后发挥神经保护作用；Trypsin-SeSP进入机体后进入脑组织发挥神经保护作用，经肝脏进代谢、肾脏排泄；ICP-MS法测定细胞和组织中Se元素的方法可靠。
3.Trypsin-SeSP能够抑制氧化应激诱导产生的神经元细胞凋亡，保护SAH后神经元。
4.Trypsin-SeSP抑制SAH后神经功能损伤，减弱脑水肿的发生具有显著治疗效果。