论文部分内容阅读
马立克氏病（Marek’s diseases,MD）由马立克氏病病毒（Marek’s diseases virus,MDV）引起的一种传染性T淋巴细胞增生性疾病。在过去的六十年,随着MD疫苗的成功研制及广泛应用,有效控制了疾病的发生。但近年来,特超强毒株的出现和野毒株毒力的增强成为疫苗免疫失败的主要原因,给养禽业带来新的威胁以及更大的经济损失。因此,有必要对鸡群中自然流行的MDV进行流行病学监控,对了解病毒的进化趋势以及现有MD疫苗保护力都具有重要意义。广西是我国优质鸡的生产大省,具有品种繁多和饲养周期长等特点,在生产中更容易发生MDV的感染。本课题对2017-2019年广西及其周边地区MDV进行分子流行病学调查,通过细胞培养进行病毒分离、IFA鉴定和致瘤基因meq的序列测定,共分离到23株MDV分离株。序列分析结果显示,23株分离株相似性较高,与中国广西早期分离株GX0101亲缘性较近;根据其氨基酸位点及系统进化树分析,均有中国超强或特超强毒株的特点;对分离株病例背景进行分析发现,均从免疫过MD疫苗的鸡群中所分离,且多以与其他两个肿瘤病病毒（禽白血病病毒和网状内皮组织增殖病病毒）混合感染（73.9%,17/23）。结合本课题所分离的23株MDV的meq基因和Gen Bank数据库里过去55年（1964-2019）已发表的149株MDV meq基因序列,分别构建三个数据集,通过贝叶斯系统动力学方法进行分析。系统发育树显示,全球172株MDV被分为2个clusters,Cluster 1有71株,包括温和型毒株、疫苗毒株和国外强毒株;Cluster 2有101株,主要以中国强毒分离株为主,本课题的23株分离株构成一个相对独立的进化簇;地理系统分析显示,揭示中国早期的MDV源自国外（美国、日本）,并呈现由北方到南方蔓延扩散的趋势;种群动态分析发现,自2005年起,中国分离株meq基因的遗传多样性呈现持续增长趋势,并分别在2007-2012和2015-2019呈现强的上升趋势。本课题对从免疫了MD疫苗的种鸡群中临床暴发MD病鸡中分离到的GX18NNM4分离株进行了致病性研究,内容包括人工感染试验和商品疫苗免疫保护试验,从临床肿瘤发生及其病理组织学观察、MDV病毒载量的动态检测、细胞因子PD-1和PD-L1的m RNA表达水平检测、免疫保护指数（protection index,PI）等方面进行评价,探究分离株的致病性以及现有商品疫苗的保护效果。未免疫攻毒组鸡只出现垂翅、羽毛粗乱、消瘦、精神沉郁等临床症状,最早于攻毒后16天出现死亡,剖检发现在心脏、肝脏、脾脏和胰腺等器官有肿瘤;免疫CVI988和814疫苗攻毒组的鸡只最早出现死亡分别在攻毒后22天和18天,剖检发现部分鸡只心脏、胰腺等器官有肿瘤;未免疫攻毒组外周血淋巴细胞的病毒载量在攻毒后28天达到峰值103.7copies/106个细胞,而两个疫苗免疫攻毒组的病毒载量在各个检测时间点均低于未免疫攻毒组的;对MDV感染鸡的脾脏和盲肠扁桃体进行PD-1和PD-L1 m RNA表达水平检测,发现PD-1或PD-L1 m RNA脾脏的表达明显高于盲扁（P<0.05）,但总体趋势基本相同,值得注意的是,在未免疫攻毒组中表达水平显著高于免疫攻毒组（P<0.05）。未免疫攻毒组肿瘤发生率为70.7%（41/58）,CV1988疫苗攻毒组的肿瘤发生率为42.5%（17/40）,保护指数39.9%。免疫814疫苗攻毒组的肿瘤发生率为27.5%（11/40）,保护指数61.1%。本课题研究揭示了早期中国MDV的来源及其传入我国后的传播扩散方向以及中国分离株meq基因遗传多样性的变化规律,同时证明目前MD在南方优质鸡中仍呈地方性的流行并严重危害养鸡业,出现了目前的商品疫苗已不能提供完全保护的vv或vv+MDV的分离株。