【摘 要】
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核酸外切酶具有切割RNA分子的作用,能控制特异RNA分子的表达水平,进而保证生物体的正常发育。MDF（Maternally-Derived Factor）是一类3’-5’外切核酸酶,能够以序列非特异性的方式降解RNA,对维持植物体内的RNA稳定及水平起着非常重要的作用。各种RNA的产生与降解对于植物发育至关重要,特别是对一些关键发育时期的作用已有不少研究,并成为近年来的热点。然而,核酸酶MDF在植
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核酸外切酶具有切割RNA分子的作用,能控制特异RNA分子的表达水平,进而保证生物体的正常发育。MDF（Maternally-Derived Factor）是一类3’-5’外切核酸酶,能够以序列非特异性的方式降解RNA,对维持植物体内的RNA稳定及水平起着非常重要的作用。各种RNA的产生与降解对于植物发育至关重要,特别是对一些关键发育时期的作用已有不少研究,并成为近年来的热点。然而,核酸酶MDF在植物配子发育和早期胚胎发生过程中的作用迄今仍知之甚少。因此,本论文的主要围绕拟南芥核酸酶MDF家族基因在配子发育和胚胎发生中的功能开展了相关研究工作。首先,我们对核酸酶MDF家族基因进行了系统分析,并选择亲缘关系比较近的5个同源基因（命名为MDF1、MDF2、MDF3、MDF4、MDF15）作为本论文的主要研究对象。通过转录组数据库分析MDF家族基因在配子和胚胎中的表达情况,结果显示MDF1、MDF2、MDF3、MDF15这四个基因在卵细胞、受精后14小时及24小时的合子和二细胞原胚中皆有相对较高的表达水平。值得一提的是MDF4在精细胞和卵细胞中均不表达,但受精后14小时开始表达且表达量迅速提高,至受精后24小时表达量最高,之后,表达量便逐渐降低。我们构建了MDF家族基因融合蛋白转基因株系,观察了它们在配子和早期胚胎中的表达模式。发现MDF2、MDF3在花粉、卵细胞和合子中均有表达,MDF2在二胞时期也有表达。MDF15在卵细胞、合子和二胞时期有表达,MDF1在花粉中有表达。随后,我们构建了MDF多基因纯合突变体,并仔细观察了mdf1 mdf2 mdf3突变体的表型,发现mdf1 mdf2mdf3突变体胚胎发育与野生型没有明显差异,暗示着MDF家族基因在早期胚胎发育过程中存在着功能冗余。其次,为了探讨核酸酶MDF可能降解的靶基因,我们采用生物信息的方法预测了MDF可能作用的靶基因DMT,并通过过量表达DMT来研究其对早期胚胎发育的影响。通过大量筛选工作,我们鉴定得到3个MDF可能的下游靶基因（命名为DMT1、DMT3、DMT50）。它们在早期胚胎中表达水平的升高都会导致胚胎发育异常。DMT1过表达导致种子结实率显著降低,不同过表达转基因株系结实率为43-57%,透明分析败育种子的胚胎主要停滞在早期合子阶段。DMT3过表达同样会导致种子结实率显著降低,不同过表达转基因株系结实率为51-56%。透明分析发现败育种子的胚胎主要停滞在早期合子阶段。DMT50过表达也会导致种子结实率显著降低,不同过表达转基因株系结实率为34-74%,败育种子的胚胎主要停滞在早期合子阶段。综上,通过本论文研究,我们鉴定得到5个在卵细胞和早期胚胎中表达的核酸酶基因MDF,通过构建mdf1 mdf2 mdf3突变体,发现其配子和胚胎发生与野生型没有明显差异,暗示其基因功能冗余。通过生物信息学方法预测MDF可能作用的靶基因DMT,并通过大量的筛选工作成功筛选到三个在早期胚胎中过表达会导致胚胎发育异常的基因,这三个基因可能是MDF下游靶基因。表明核酸酶MDF家族基因可能在拟南芥配子发育和胚胎发生的过程中有至关重要的作用。
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