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目的通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)和逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)分别检测慢性牙周炎患者龈下菌斑中四种不同rag基因型牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.gingivalis)的分布,和不同牙周炎症状态下rag-1型基因RNA水平的表达差异。探讨不同rag基因型P.gingivalis在慢性牙周炎患者中的分布情况,及不同牙周炎症状态下rag-1型基因的表达规律。材料与方法1、研究对象的选择选择中国医科大学附属口腔医院牙周科就诊的慢性牙周炎患者50例。所有受试者均要求无全身系统性疾病,妇女无妊娠,至少1年内未接受过牙周系统治疗,近3个月内未服用抗菌药物,知情同意。2、牙周临床指标检查选取患者口腔中三个慢性牙周炎病变位点。记录受试位点牙周探诊深度(Probing Depth,PD),临床附着丧失(Clinical Attachment Loss,CAL),并通过x光片记录牙槽骨吸收程度。所有检查内容均由同一检查者完成。3、样本采集用无菌牙签取被检牙位龈下菌斑,置于装有1ml的PBS缓冲液的无菌离心管中,提取DNA和RNA。4、样本分组根据记录取样位点的牙周临床指标,将50例慢性牙周炎患者的菌斑样本分为轻度慢性牙周炎组(简称轻度组)和中重度慢性牙周炎组(简称中重度组)。5、P.gingivalis的检测酚-氯仿法提取DNA;P.gingivalis 16S rDNA特异性引物PCR扩增;1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。6、四种rag基因型的检测用四种rag基因特异性引物进行P.gingivalis阳性DNA样本的PCR扩增;1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。7、RT-PCR应用细菌RNA提取试剂盒提取rag-1型基因阳性菌斑的RNA。P.gingivalis 16SrDNA作为内参对照基因,进行RT-PCR。1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测,凝胶成像系统拍照,测量灰度值。8、统计学分析采用SPSS11.0统计软件进行数据处理。用x~2检验、t检验及秩相关检验进行统计学分析。显著水平:P＜0.05时有显著性差异,P＜0.01时有高度显著性差异。检验水准为双侧α=0.05。结果1、P.gingivalis的检测结果P.gingivalis的总检出率为70.6%,中重度组和轻度组的检出率分别为74.4%和66.7%,两者之间无统计学差异。2、四种rag基因型的检出情况四种rag基因型的检出率分别为60.4%、23.6%、44.3%和15.1%。其中rag-1型的检出率最高(P＜0.01),rag-3型次之(P＜0.05),rag-2型和rag-4型的检出率无统计学差异(P＞0.05)。rag-1,3型(同时含有rag-1型和rag-3型,含有或不含有其它rag基因型)的联合检出率为19.8%,明显高于其他任意两型的联合检出率(P＜0.01)。rag-1型在中重度组的检出率高于轻度组(P＜0.05),rag-4型在轻度组的检出率高于中重度组(P＜0.05)。rag-2型和rag-3型的组间检出率无统计学差异(P＞0.05)。rag-1,3型在中重度组的联合检出率高于轻度组(P＜0.05)。其余任意两型的组间联合检出率均无统计学差异(P＞0.05)。3、rag-1基因在不同牙周炎症状态下RNA表达检测结果轻度组、中度组和重度组的rag-1型基因RNA表达水平分别显示增强,减弱和增强。轻度组和重度组rag-1型基因的RNA表达水平与牙周炎症状态呈正相关,而与中度组则呈负相关。结论1、不同rag基因型的P.gingivalis在慢性牙周炎患者龈下菌斑中的分布有所不同。rag-1型的检出率最高,其次为rag-3型,表明rag-1型和rag-3型基因与我国人群慢性牙周炎的发生发展密切相关。rag-1型在中重度组的检出率高于轻度组,表明携带rag-1型基因的P.gingivalis更能造成牙周组织严重的破坏,与中重度慢性牙周炎密切相关。2、rag-1型基因在轻度组、中度组和重度组的RNA表达水平分别呈现增高-降低-增高的趋势,表明rag-1型基因的RNA表达水平随着牙周组织破坏程度及炎症状态的不同而改变。